大腸癌(colorectal cancer,CRC)是危害人類健康的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,并位于全球常見惡性腫瘤的第3位。手術是目前大腸癌治療的首選方法,但化學藥物是治療大腸癌的重要手段。而天然來源藥物或者是基于天然產(chǎn)物合成的衍生物在腫瘤治療中已取得顯著的效果,且因其毒副作用低、靶點多而越來越成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點。法氏囊五肽和金雀異黃素均是天然來源的化合物。法氏囊五肽BP5(Bursopentin,Cys-Lys-Arg-Val-Tyr)是從雞法氏囊中分離到的一種新的多功能性活性五肽。據(jù)報道,BP5能參與調(diào)節(jié)多條與抗腫瘤活性相關的細胞信號通路。然而,目前尚無相關文獻報道BP5對腫瘤細胞生長抑制作用的研究。金雀異黃素(Genistein,Gen)廣泛分布于葛根、槐角、金雀花、山豆根等豆科植物中,是很多中草藥的天然活性成分之一。研究表明,Gen能誘導腫瘤細胞凋亡、抑制增殖、抑制多種藥物的耐藥性等。本研究首先對BP5抑制結(jié)腸癌HCT116細胞的作用及其機制展開了研究,研究發(fā)現(xiàn)BP5通過誘導G1期細胞周期阻滯、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及線粒體介導的caspase依賴性的凋亡途徑抑制結(jié)腸癌HCT116細胞生長。在此基礎上開展了 BP5與抗腫瘤中藥單體Gen的聯(lián)合應用的初步研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者能協(xié)同抑制HCT116細胞的生長、誘導細胞凋亡和自噬。此外,通過收集揚州市中醫(yī)院158例大腸癌病例,對大腸癌的臨床分布、病理特征、中醫(yī)證型及治療方式等進行回顧性分析,結(jié)果表明,結(jié)腸癌和直腸癌在年齡、中醫(yī)證型、治療方法上具有明顯差異,而在性別、病理大體分型、組織學分類、組織分化程度、臨床分期、轉(zhuǎn)移情況上并無明顯差異性。本課題研究內(nèi)容共分為三個部分。第一部分法氏囊五肽對結(jié)腸癌HCT116細胞增殖的作用及機制目的:探討B(tài)P5對結(jié)腸癌HCT116細胞的抗癌作用及其可能機制。方法:用細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)測定細胞活力。分別使用碘化丙啶(PI)和Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞周期和凋亡率。通過Western blot法檢測細胞周期相關蛋白和凋亡相關蛋白來分析其作用機制。使用特異性siRNAs對IREI、ATF-6和PERK進行基因沉默實驗。用H2DCF-DA綠色熒光探針染色法測定細胞內(nèi)活性氧(ROS)。分別使用Fluo-3 AM和JC-1染色試劑盒檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度和線粒體膜電位(△Ψm)。結(jié)果:BP5對HCT116細胞的增殖具有抑制作用,呈劑量-時間依賴性,并具有誘導細胞凋亡的作用。BP5通過上調(diào)p53和p21以及下調(diào)Cyclin E1和CDK2誘導G1期細胞阻滯。同時,BP5通過激活未折疊蛋白應答(UPR)效應分子(IRE1α、ATF6、PERK)和下游信號(XBP-1s、eIF2α、ATF4和CHOP)通路,顯著誘導了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應激介導的細胞凋亡途徑,促進活性氧生成和細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。此外,BP5增加了促凋亡蛋白Bax的表達,減少了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,降低了線粒體膜電位(△Ψm),導致線粒體向細胞質(zhì)釋放細胞色素c,從而增強了 caspase-9和caspase-3的活性。此外,實驗表明,caspase抑制劑(z-VAD-fmk)能顯著拮抗BP5對HCT116細胞的抑制作用以及BP5誘導的細胞凋亡。結(jié)論:BP5通過誘導G1期細胞周期阻滯、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及線粒體介導的caspase依賴性的凋亡途徑,從而抑制結(jié)腸癌HCT116細胞生長。第二部分法氏囊五肽和金雀異黃素聯(lián)合應用的初步研究目的:研究BP5和Gen的聯(lián)合應用對結(jié)腸癌HCT116細胞的作用,并探討其可能的機制。方法:CCK-8法測定細胞活性。Annexin V-APC/7AAD染色法檢測細胞凋亡。單丹磺酰尸胺(MDC)染色法檢測細胞自噬。蛋白質(zhì)印跡分析觀察細胞凋亡相關蛋白和自噬相關蛋白。結(jié)果:與單用BP5或Gen處理組相比,BP5和Gen聯(lián)合處理組可通過增加Bax的表達水平,降低Bcl-2的表達水平,提高caspase-3和裂解的caspase-3的活性協(xié)同抑制HCT116細胞的生長、誘導細胞凋亡,并通過增加LC3-II和降低p62的表達水平誘導自噬性細胞死亡。結(jié)論:BP5和Gen的聯(lián)合應用可通過誘導HCT116細胞凋亡和自噬顯示其協(xié)同抗癌作用。第三部分158例大腸癌臨床特征回顧性分析目的:探索大腸癌在臨床分布、病理特征及診斷和治療上的臨床特點。方法:通過回顧性分析揚州市中醫(yī)院2016年10月至2018年10月腫瘤科診斷為大腸癌的患者資料158例,將大腸癌分為結(jié)腸癌和直腸癌兩組,并對兩組腸癌患者的性別、年齡、病理大體分型、組織學分類、組織分化程度、臨床分期、中醫(yī)證型、轉(zhuǎn)移情況、治療方法進行整合分析。結(jié)果:1.結(jié)直腸癌在性別、病理大體分型、組織學分類、組織分化程度、臨床分期、轉(zhuǎn)移情況上差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)直腸癌在發(fā)病率上均是男性高于女性,結(jié)腸癌男性構成比例(62.37%)略低于直腸癌(64.62%)。病理大體分型50%以上為潰瘍型,在組織學分類上80%以上為腺癌,少部分為粘液腺癌,其他類型極少,病理分化程度超過半數(shù)以上為中分化。結(jié)直腸癌中晚期患者所占比例遠超過早期患者,單純淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移患者所占比例較高。2.結(jié)直腸癌在年齡、中醫(yī)證型、治療方法上差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。在患病年齡上,結(jié)直腸癌老年患者多于中青年患者,其中直腸癌中年發(fā)病率(33.85%)略高于結(jié)腸癌(21.51%),而青年發(fā)病率直腸癌(1.54%)卻低于結(jié)腸癌(10.73%)。結(jié)腸癌老年患者所占比例(67.74%)略高于直腸癌(64.61%)。在中醫(yī)證型方面,結(jié)直腸癌患者以痰濕內(nèi)停證為主,其次為脾氣不足證。結(jié)腸癌氣血兩傷證患者比直腸癌多,直腸癌在肝腎陰虛證、瘀毒內(nèi)結(jié)證及脾腎陽虛證上患者數(shù)多于結(jié)腸癌。結(jié)直腸癌在治療方式上大多以手術+化療方式,其次是純手術治療,但直腸癌手術+化療+放療所占比例大于結(jié)腸癌。結(jié)論:結(jié)腸癌和直腸癌在年齡、中醫(yī)證型、治療方法上具有明顯差異,而在性別、病理大體分型、組織學分類、組織分化程度、臨床分期、轉(zhuǎn)移情況上并無明顯差異性。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

３結(jié)果??３．１?ＢＰ５對ＨＣＴ１１６細胞、ＨａＣａＴ細胞和ＮＩＨ／３Ｔ３細胞增殖的影響??如圖１－１Ａ所示，ＢＰ５顯著降低ＨＣＴ１１６細胞的存活率，并呈時間和劑量依賴性。根??據(jù)ＣＣＫ－８測定結(jié)果，選擇２、４和８?ｍＭ濃度的ＢＰ５進行后續(xù)實驗。使用光學顯微鏡觀??察ＢＰ５對ＨＣＴ１１６細胞生長的影響。顯微鏡檢查顯示ＢＰ５處理后的細胞形態(tài)畸變、分??離、縮小、呈圓形，而對照組細胞形態(tài)致密、附著。同時，在ＢＰ５處理的細胞中，脫落??細胞的數(shù)量以劑量依賴性的方式增加（圖１－１Ｃ）。此外，本實驗還研宄了?ＢＰ５對人角質(zhì)??形成細胞ＨａＣａＴ和小鼠成纖維細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞增殖的影響。研宄結(jié)果顯示，用不同濃??度的ＢＰ５?（０．５－１６?ｍＭ）處理ＨａＣａＴ和ＮＩＨ／３Ｔ３細胞７２ｈ后，細胞活力顯著下降（圖１－??１Ｂ）?〇??Ａｉ１００?ＴＶ，?Ｂｉ１００?ｌｘ?５＂：，一－－：?３??Ｉ：：：?＾??Ｔ；?＾?

３．３?ＢＰ５誘導ＨＣＴ１１６細胞凋亡??流式細胞術分析顯示，與對照組相比，ＢＰ５處理組細胞凋亡水平明顯升高。此外，??經(jīng)ＢＰ５處理２４ｈ后，ＨＣＴ１１６細胞的凋亡率呈劑量依賴性增加（圖１－３Ａ和Ｂ）。??Ａ?￡?４．５３?％?０．２２?％＇?２?８．１３?％?４．２９?％！?Ｂ?４０?ｉ??ｃｂ?〇■??——Ｊｆ—－ｉ?＾?Ｔ??—２?＃?－２?ｊＦ?１３０－?Ｔ?－??％?９４．８９％?０．３６％?ｆｅ?８２．９５?％?４．６３％）?Ｓ?＿??－ｉｏ°?ｉｏ１?ｉｏ－＇?Ｔｏ＊?ｌｏ＂?－ｉｏ°?ｉｏ＞?ｉｃＨ?ＩＦ?ｉ〇４?〇，??Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ?ＦＩＴＣ?Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ?ＦＩＴＣ?〇??，?Ｃｏｎｔｒｏｌ?，?２?ｍＭ?ｇ＊２０??ＥＩｌ７．８２％２Ｋ５１％?－１９．５６％?１８．４３％］?＾??ｓｍ

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本文編號：2867011