發(fā)布時(shí)間：2020-11-02 02:41

　　 目的:針對(duì)臨床應(yīng)用蛇六谷藥材基原混亂的問(wèn)題,研究建立蛇六谷藥材傳統(tǒng)鑒定方法及分子標(biāo)記DNA條形碼鑒定方法,明確該藥材基原,為臨床合理安全用藥提供科學(xué)依據(jù);同時(shí)進(jìn)行蛇六谷抗腫瘤活性部位及敏感腫瘤細(xì)胞的篩選,為蛇六谷抗腫瘤活性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù),為蛇六谷抗腫瘤的深入開(kāi)發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。方法:采用文獻(xiàn)綜述方法,查閱歷代本草對(duì)蛇六谷記載,進(jìn)行基原考證,并收集各地收錄蛇六谷藥材標(biāo)準(zhǔn)及炮制規(guī)范,通過(guò)實(shí)地調(diào)研,收集各種樣品共21份;采用原植物性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜鑒別、含量測(cè)定及建立特異性引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA條形碼分子鑒定技術(shù)等對(duì)蛇六谷的基原進(jìn)行確定,并全面提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),增強(qiáng)質(zhì)量可控性;采用CCK-8法對(duì)系統(tǒng)溶劑法制備的蛇六谷不同極性部位活性進(jìn)行篩選,以及對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌HepG-2細(xì)胞、人胃癌GTL-16細(xì)胞、人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞和人乳腺癌MCF-7細(xì)胞進(jìn)行蛇六谷體外抗腫瘤活性研究,并通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡進(jìn)一步研究蛇六谷活性部位抑制腫瘤增值的活性。結(jié)果:1.對(duì)收集得到的21份蛇六谷樣品通過(guò)文獻(xiàn)描述和進(jìn)行傳統(tǒng)方法鑒定,找出了種間性狀差異,確定蛇六谷藥用植物基原為天南星科魔芋屬的魔芋和疏毛魔芋兩種,經(jīng)過(guò)顯微鑒別、薄層鑒別、含量測(cè)定研究證明樣品編號(hào)1、3、4、6、8、9、11、12、13、14、15、N、X、Y、G、S、J為蛇六谷正品魔芋和疏毛魔芋,樣品編號(hào)2、5、7為蛇六谷偽品,樣品編號(hào)10性狀與蛇六谷性狀相似,但是無(wú)薄層行為,未鑒定出;通過(guò)DNA條形碼分子鑒定技術(shù),對(duì)蛇六谷藥用基原植物疏毛魔芋設(shè)計(jì)出特異性PCR引物,建立的DNA條形碼分子鑒定方法可快速檢測(cè)出蛇六谷藥用植物疏毛魔芋。2.體外抗腫瘤活性研究表明,蛇六谷對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞、人胃癌GTL-16細(xì)胞、人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞均具有良好的抑制增殖作用,且呈現(xiàn)出較好的劑量-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系;通過(guò)比較不同極性部位對(duì)體外培養(yǎng)的上述四種腫瘤細(xì)胞抑制率和IC50值,表明乙酸乙酯部位具有較高的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性,且其對(duì)人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞的IC50值最低,為0.766mg/ml,表明蛇六谷抗腫瘤活性主要集中在乙酸乙酯部位;在用不同濃度乙酸乙酯提取物作用于上述四種細(xì)胞24h后,置熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)可見(jiàn)大部分細(xì)胞形態(tài)異常,體積縮小,失去原固有形態(tài),并且稀疏散在,密度均明顯減小、細(xì)胞貼壁能力減弱,存活數(shù)呈下降趨勢(shì);細(xì)胞壁皺縮、胞漿濃縮、透光率下降,細(xì)胞由正常的集落生長(zhǎng)變得間距變大、間連接減少,產(chǎn)生凋亡小體,證明蛇六谷乙酸乙酯萃取物可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明細(xì)胞凋亡率隨著乙酸乙酯提取物給藥濃度和時(shí)間的推移顯著增加,表明乙酸乙酯部位具有較好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。結(jié)論:1.以傳統(tǒng)鑒別方法結(jié)合DNA條形碼分子鑒定技術(shù),確定蛇六谷藥用植物基原,全面提升藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),建立能快速較好區(qū)分蛇六谷正品及偽品的方法。2.以CCK-8法對(duì)蛇六谷體外抗腫瘤活性及活性部位篩選,通過(guò)計(jì)算蛇六谷不同極性部位對(duì)四種腫瘤細(xì)胞的抑制率及IC50值得出,蛇六谷乙酸乙酯部位表現(xiàn)出較好的活性,其抑制率高于蛇六谷其他極性部位,并且對(duì)人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞的IC50值最低;細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明蛇六谷乙酸乙酯萃取物具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性,為進(jìn)一步研究蛇六谷抗腫瘤活性成分及抗腫瘤作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山西省中醫(yī)藥研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類(lèi)】：R282.5;R285
【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
第一章 蛇六谷基原鑒定
    第一節(jié) 原植物性狀鑒別
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果
        4 小結(jié)
    第二節(jié) 藥材性狀鑒別
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果
        4 小結(jié)
    第三節(jié) 顯微鑒別
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果
        4 小結(jié)
    第四節(jié) 薄層鑒別
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果
        4 小結(jié)
    第五節(jié) 多糖含量測(cè)定
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果
        4 小結(jié)
    第六節(jié)DNA分子ITS/ITS2鑒別
        1 材料
        2 方法與步驟
        3 結(jié)果與分析
        4 小結(jié)
    第七節(jié) 采用特異性引物PCR方法檢測(cè)基原
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果
        4 小結(jié)
第二章蛇六谷抗腫瘤活性部位篩選及對(duì)不同腫瘤細(xì)胞活性研究
    第一節(jié) 蛇六谷不同極性提取物制備
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果
    第二節(jié) 蛇六谷不同部位對(duì)不同腫瘤細(xì)胞抑制增殖作用初步篩選
        1 材料
        2 方法與步驟
        3 結(jié)果與分析
        4 小結(jié)
    第三節(jié) 蛇六谷乙酸乙酯萃取物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制增殖作用研究
        1 材料
        2 方法
        3 結(jié)果與分析
        4 小結(jié)
結(jié)語(yǔ)
    1 結(jié)論
    2 創(chuàng)新點(diǎn)
    3 不足與展望
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄 縮略語(yǔ)說(shuō)明
攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況
致謝

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