目的:探討七味清肝散的抗肝纖維化(HF)作用,并挖掘其潛在機(jī)制。方法:將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、HF模型組和七味清肝散低、中、高劑量組[135、270、405 mg/(kg·d),以生藥總量計(jì)],每組12只。除空白組外,其余各組均灌胃50%四氯化碳花生油溶液(2 mL/kg,每周2次,連續(xù)8周)以復(fù)制HF模型;與此同時(shí),空白組和HF模型組大鼠均灌胃等容0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,各給藥組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物,每日1次,連續(xù)8周。觀察各組大鼠的一般情況,于末次給藥后觀察其肝臟形態(tài),并測(cè)定肝臟指數(shù);檢測(cè)大鼠血清肝功能指標(biāo)[丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、羥脯氨酸(HYP)]含量以及肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)情況,并采用蘇木精-伊紅染色和Masson染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。采用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)技術(shù),以蛋白表達(dá)量的差異倍數(shù)為指標(biāo),篩選藥物組(合并七味清肝散各劑量組肝組織樣品)和HF模型組的差異表達(dá)蛋白,并借助Uniprot-GOA數(shù)據(jù)庫(kù)以及KAAS、KEGG mapper在線工具等對(duì)其進(jìn)行基因本體(GO)和KEGG通路富集分析。結(jié)果:空白組大鼠健康狀況好;肝臟呈鮮紅色且表面光滑,肝小葉完整,未見(jiàn)變性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或纖維組織增生。與空白組比較,HF模型組大鼠飲食減少、精神萎靡、皮毛雜亂且無(wú)光澤;肝臟呈暗紅色或黃色,表面粗糙,質(zhì)地較硬,可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織破壞、橋間連接等現(xiàn)象;其肝臟系數(shù)、肝功能指標(biāo)含量和α-SMA的表達(dá)水平均顯著升高(P0.05)。與HF模型組比較,七味清肝散各劑量組大鼠上述癥狀均有不同程度的改善,且低劑量組肝臟系數(shù)、高劑量組ALP含量以及各劑量組ALT、AST、HYP含量和α-SMA的表達(dá)水平均顯著降低(P0.05)。共篩選出與HF有關(guān)的差異表達(dá)蛋白42個(gè),其中表達(dá)上調(diào)15個(gè)、表達(dá)下調(diào)27個(gè),包括脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)、膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)等。富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)蛋白主要富集于細(xì)胞外空間、血液微粒等細(xì)胞部位,涉及氧化還原酶活性、脂肪酸結(jié)合等分子功能,異型細(xì)胞間黏附的調(diào)控、蛋白質(zhì)活化級(jí)聯(lián)等生物過(guò)程以及視黃醇代謝、花生四烯酸代謝、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)等信號(hào)通路。結(jié)論:七味清肝散可降低HF模型大鼠的肝臟系數(shù)以及血清中ALT、AST、ALP、HYP含量,下調(diào)α-SMA的表達(dá),改善肝組織的炎癥及纖維化程度,具有一定的肝保護(hù)作用。該方潛在抗HF作用機(jī)制可能涉及FABP4、CYP7A1、PPAR等多個(gè)靶點(diǎn)和信號(hào)通路。
【部分圖文】：

圖6 GO一級(jí)分類下的富集結(jié)果HSC激活是HF病理過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，而α-SMA是HSC激活的標(biāo)志物；HSC激活后，α-SMA呈高表達(dá)，會(huì)進(jìn)一步造成ECM合成增多、堆積，最終引發(fā)HF[24]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，HF模型組大鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)水平顯著升高；與HF模型組比較，七味清肝散各劑量組大鼠肝組織中α-SMA的表達(dá)水平均顯著降低。這提示該方可通過(guò)下調(diào)α-SMA的表達(dá)來(lái)抑制HSC的活化，從而發(fā)揮抑制HF的作用。上述結(jié)果與相關(guān)研究[11]基本一致。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)蛋白主要富集于類固醇激素的生物合成、視黃醇代謝、組氨酸代謝、花生四烯酸代謝、細(xì)胞色素P450代謝外源物質(zhì)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）等信號(hào)通路（P<0.05）。其中，視黃醇代謝、花生四烯酸代謝和PPAR信號(hào)通路與HF有關(guān)[13-14]，且PPAR信號(hào)通路中富集到了經(jīng)七味清肝散作用后下調(diào)的脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4）和膽固醇7α-羥化酶（CYP7A1），二者亦與HF密切相關(guān)[15-17]。圖2 各組大鼠肝組織Masson染色病理切片顯微圖（×100)

各組大鼠肝組織Masson染色病理切片顯微圖（×100)
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