知母-黃柏藥對是中醫(yī)常用來治療糖尿病的經典藥對。中藥配伍可以改變藥效物質進入體內的吸收及代謝過程,從而改變其作用途徑和作用靶點,以達到增效減毒的目的。本文采用“四段式”研究方法,即對提取物、門靜脈血(入肝前)、肝臟(主要的代謝和藥效靶點器官)和外周血(出肝后)四部分進行定量分析和藥動學考察,并結合體外腸道菌和原代肝細胞孵育實驗,探討知黃配伍前后藥效成分在大鼠體內的代謝和藥動過程變化,從代謝和藥動角度側面闡明知母黃柏單味及藥對的藥效物質基礎和部分配伍機制。1.采用“四段式”策略研究知母藥效物質基礎建立了同時檢測知母7種成分(包括3種口山酮類成分和4種皂苷類成分)的HPLC-MS/MS定量方法并對其進行方法學考察,然后將該方法用于知母“四段式”研究,其結果為:知母提取物的含量順序為Timosaponin B2(1)Mangiferin(0.33)Timosaponin B3(0.24)Neomangiferin(0.05)Timosaponin A3(0.005);門靜脈血中化合物的暴露量順序為Mangiferin(1)Norathyriol(0.38)Timosaponin B2(0.29)Timosaponin B3(0.22)Timosaponin A3(0.13)Neomangiferin(0.01),口山酮類原形成分Mangiferin及代謝物Norathyriol在門靜脈血的暴露量很高,而Neomangiferin的暴露量最小,皂苷類成分Timosaponin B2、Timosaponin B3和Timosaponin A3也有一定的暴露量,由此可知門靜脈血中各成分的暴露量順序和它們在提取物中的含量順序并不一致;肝臟中主要以Timosaponin A3和Norathyriol為主,尤其Timosaponin A3大量蓄積,Timosaponin A3(1)Norathyriol(0.02);外周血中暴露量順序變?yōu)镸angiferin(1)Timosaponin B2(0.15)Timosaponin B3(0.10)Norathyriol(0.09)Timosaponin A3(0.08)Neomangiferin(0.01),可知藥材含量較低的Mangiferin暴露量最高。結合上述“四段式”研究結果及體外的腸道菌和原代肝細胞的代謝結果,可以推測知母成分的大鼠體內過程:提取物中含量最高的皂苷類成分Timosaponin B2、Timosaponin B3在門靜脈和外周血中都保持一定的暴露量,其肝臟提取率分別為67.5%和70.4%,表明皂苷類原形成分的肝臟首過效應比較嚴重,但體內外實驗證明Timosaponin B2和Timosaponin B3在肝臟中既不代謝也不蓄積,因此推測皂苷類肝首過效應可能與肝臟消除(如膽汁外排)有關;大鼠體內的Timosaponin A3主要是由知母中的皂苷類原形成分(如Timosaponin B2、Timosaponin B3)在腸道菌作用下代謝產生,并且在肝臟中存在大量蓄積;門靜脈血和外周血中暴露量最高的mangiferin主要來自于提取物中的mangiferin原形,還有一部分來自于neomangiferin的代謝,肝臟對mangiferin的提取率為35.6%,但mangiferin既不在肝臟中蓄積也不發(fā)生肝臟代謝,推測門靜脈血中的mangiferin大部分進入到體循環(huán),另一部分可能通過肝臟消除排出體外;體內的口山酮類代謝物norathyriol是由mangiferin和neomangiferin在腸道菌作用下代謝而來,并且在肝臟中存在蓄積。2.采用“四段式”策略系統(tǒng)研究黃柏藥效物質基礎建立了同時檢測黃柏八個成分的hplc-ms/ms定量方法(包括3種生物堿原形和5種berberine代謝物)并對其進行方法學考察,然后將該方法用于黃柏的“四段式”研究,結果發(fā)現(xiàn):黃柏提取物主要以berberine、phellodendrine、magnoflorine這三種生物堿為主,berberine(1)phellodendrine(0.23)magnoflorine(0.15);其他五種berberine的代謝物成分在藥材中含量非常低,均低berberine含量的5%;門靜脈血的暴露量順序為magnoflorine(1)phellodendrine(0.74)berberine(0.46)berberrubine(0.12)thalifendine(0.05),可知大鼠經口服吸收,進入門靜脈血的化合物暴露量順序與提取物并不一致;肝臟中,各成分的暴露量順序較門靜脈血變化顯著,berberine(1)berberrubine(0.96)thalifendine(0.87)jatrorrhizine(0.68)magnoflorine(0.57)phellodendrine(0.55)demethyleneberberine(0.12)columbamine(0.08),berberine的肝臟暴露量最多,其次為其代謝物berberrubine、thalifendine、jatrorrhizine;外周血中,magnoflorine的暴露量最高,暴露量順序為magnoflorine(1)berberine(0.25)thalifendine(0.09)berberrubine(0.07)phellodendrine(0.05)。結合上述“四段式”研究結果及體外的腸道菌和原代肝細胞的代謝結果,可以推測黃柏成分的大鼠體內過程:phellodendrine在門靜脈血中有一定的暴露,其肝臟提取率為96.1%,表明肝臟對phellodendrine存在很強的首過效應,這與phellodendrine在肝臟中的蓄積,且存在的肝臟代謝有關;magnoflorine在門靜脈-肝臟-外周血中均存在一定的暴露,其肝臟提取率為47.5%,這可能與magnoflorine在肝臟中存在的蓄積有關,而magnoflorine并不在肝臟中代謝;berberine在門靜脈血、外周血和肝臟中均有一定量的暴露,其肝臟提取率為71.5%,表明肝臟對berberine存在較強的首過效應,這與體外實驗中檢測到berberine經腸道菌和肝臟的作用下發(fā)生廣泛的代謝相關,且代謝過程中生成了berberrubine、thalifendine、demethyleneberberine、jatrorrhizine、columbamine五個代謝物。這些代謝物都在肝臟存在較大的暴露,另外代謝物berberrubine、thalifendine在門靜脈血和外周血中也可以檢測到。以上實驗分別采用“四段式”中藥及復方藥效物質研究策略對知母和黃柏提取物中的藥效成分群在體內外進行系統(tǒng)研究。因此,通過“四段式”可以較全面、系統(tǒng)地闡述知母和黃柏中主要成分(包括原形和代謝物)的體內動態(tài)過程,從代謝和藥動學角度側面闡明單味知母和黃柏的藥效物質基礎,為后續(xù)研究知母黃柏藥對的藥效物質基礎和配伍機制奠定基礎。3.采用“四段式”策略系統(tǒng)研究知母黃柏藥對配伍機制通過比較知母黃柏單味組及配伍組的“四段式”結果發(fā)現(xiàn),知母黃柏單煎與合煎后的提取物中各成分未見明顯的變化。然而經大鼠口服后,與黃柏的配伍會導致知母皂苷類成分在門靜脈血和外周血中的暴露量顯著改變,其中timosaponinb2分別提高了67%和149%,timosaponinb3分別降低了41%和29%,timosaponina3分別降低了51%和22%,而timosaponina3在肝臟中的蓄積量增加了57%;知母口山酮類成分在門靜脈血和外周血中的暴露量皆有所下降,neomangiferin分別降低了40%和23%,mangiferin分別降低了54%和58%,norathyriol均降低了82%左右,而norathyriol在肝臟中的暴露量卻提高了198%。另一方面,知母的存在,使得生物堿類成分phellodendrine、magnoflorine和berberine在門靜脈血-肝臟-外周血中的暴露量都有顯著上升:phellodendrine分別提高了64%、181%和195%,magnoflorine分別提高了110%、31%和67%,berberine分別提高了234%、233%和169%。此外,berberine代謝物berberrubine、thalifendine在門靜脈血和外周血中暴露量也顯著升高,并且thalifendine、demethyleneberberine、columbamine在肝臟中的蓄積量也均有增多,推測知母中的成分可以與黃柏中的成分發(fā)生代謝酶或者轉運體的藥物相互作用,從而導致上述化合物體內暴露量的改變。采用“四段式”中藥及復方藥效物質研究策略,對知母黃柏單味及配伍的主要原形成分及代謝物成分進行了體內外含量及暴露量比較,結果表明配伍煎煮過程對知母黃柏中藥效成分的含量影響較小,但配伍對大鼠口服后的體內原形成分和代謝物成分的藥動學影響比較顯著,包括口山酮類成分在入肝前后血中的暴露量皆降低,而生物堿類成分卻均升高,皂苷類成分timosaponinb2在入肝前后血中的暴露量增多,而timospaoninb3的暴露量卻減少,特別值得注意的是肝臟內口山酮類、皂苷類及生物堿類代謝物的暴露量均有不同程度的提高。結合化合物的藥理報道,體內多成分代謝及動力學特征的變化規(guī)律和差異,推測知母黃柏的配伍機制可能除了提高原形成分如黃柏中降糖生物堿類成分magnoflorine、berberine進入體內血液及肝臟的量,更重要的是還可以提高知上海師范大學碩士學位論文摘要母中的代謝物Timosapanin A3、Norathyriol和黃柏中Berberine代謝產物進入肝臟的量,從而起到增強藥效的作用。
【學位單位】：上海師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 中藥藥對的研究概述
        1.1.1 中藥藥對的研究進展
        1.1.2 知母-黃柏藥對的研究意義
    1.2 知母-黃柏藥對的藥效成分及研究進展
        1.2.1 知母的藥效成分研究進展
        1.2.2 黃柏的藥效成分研究進展
    1.3 知母-黃柏藥對藥效成分的藥代動力學及研究進展
        1.3.1 知母藥效成分的藥代動研究進展
        1.3.2 黃柏藥效成分的藥代動研究進展
    1.4 本文立題依據及研究目標
第2章 知母提取物定量分析及大鼠體內藥動學研究
    2.1 前言
    2.2 實驗過程
        2.2.1 儀器與試藥
        2.2.2 實驗條件
        2.2.3 分析方法學考察
        2.2.4 知母提取物的大鼠體內藥代動力學實驗
        2.2.5 知母提取物的大鼠體外代謝實驗
    2.3 實驗結果
        2.3.1 分析方法學考察
        2.3.2 藥動學研究
    2.4 本章小結
第3章 黃柏提取物定量分析及大鼠體內藥動學研究
    3.1 前言
    3.2 實驗過程
        3.2.2 實驗條件
        3.2.3 分析方法學考察
        3.2.4 黃柏提取物的大鼠體內藥代動力學實驗
        3.2.5 黃柏提取物的大鼠體外代謝實驗
    3.3 實驗結果
        3.3.1 分析方法學考察
        3.3.2 藥動學研究
    3.4 本章小結
第4章 知母-黃柏藥對的大鼠體內藥動學研究
    4.1 前言
    4.2 實驗過程
        4.2.1 儀器與試藥
        4.2.2 實驗條件
        4.2.3 知黃提取物的大鼠體內藥代動力學實驗
    4.3 實驗結果
        4.3.1 知黃提取物的含量測定
        4.3.2 知黃成分的藥動學研究
    4.4 本章小結
全文總結
參考文獻
致謝
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本文編號：2864134