阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征。認(rèn)知功能障礙(Cognitive Dysfunction,CD)是逐漸向AD惡化的始端,CD的治療對于防治AD具有重要意義。CD的病機(jī)發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜,心藏神,腎藏精,神明聰慧,精養(yǎng)腦髓,心腎相交,神清腦明。心腎不交,心火旺盛,腎精虛衰,神擾髓消,聰慧不生。其中腎虛心火亢盛,心腎不交可能是發(fā)病機(jī)制之一。交泰丸作為治療心腎不交的經(jīng)典方劑,交通心腎,使心火清,腎精盈,神明內(nèi)守,腦髓得養(yǎng)。交泰丸出自明代《韓氏醫(yī)通》,是一首治療失眠的名方,由黃連、肉桂兩味藥物組成,具有交通心腎,清火安神的功效。交泰丸中黃連具有保護(hù)神經(jīng)元、改善神經(jīng)炎癥、緩解糖尿病引起的認(rèn)知功能損傷的作用,肉桂則具有保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善膽堿能系統(tǒng)的作用。目的:我們提出假設(shè),認(rèn)為交泰丸可能具有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、改善認(rèn)知功能障礙癥狀的作用,基于以上設(shè)想我們開展交泰丸對東莨菪堿模型小鼠認(rèn)知功能障礙的作用及藥效機(jī)制的研究。通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察交泰丸低、中、高劑量對小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的影響情況;通過研究交泰丸對腦組織膽堿能系統(tǒng)和氧化應(yīng)激系統(tǒng)的相關(guān)指標(biāo),以及對神經(jīng)元退行性病變情況和細(xì)胞凋亡情況的影響,探討交泰丸在改善東莨菪堿模型小鼠認(rèn)知功能障礙方面的作用機(jī)制。方法:將昆明小鼠96只雌雄各半,體重21-23g,隨機(jī)分為6組。(1)利用Morris水迷宮、Y迷宮、新物體識別、條件恐懼實(shí)驗(yàn)觀察小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善情況。(2)采用分光光度法檢測小鼠腦組織乙酰膽堿(Ach)水平、乙酰膽堿酯酶(AChE)及乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平、總超氧化物歧化酶(SOD)以及過氧化氫酶(CAT)活性。(3)利用免疫印跡(western blotting)法檢測神經(jīng)元BDNF,NGF,PSD95和SYN蛋白的表達(dá)情況以及凋亡蛋白Bcl-2,Bax,Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。(4)采用尼氏染色和Tunel染色觀察神經(jīng)元的改變以及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:交泰丸制劑中含有八種主要有效成分分別為木蘭花堿(Magnoflorine)、格蘭地新(Groenlandicine)、黃連堿(Coptisine)、藥根堿(Jatrorrhizine)、非洲防己堿(Columbamine)、小檗堿(Berberine)、巴馬汀(Palmatine)、桂皮醛(Cinnamaldehyde)。其中均含有黃連、肉桂的有效成分小檗堿、肉桂醛,并且小檗堿所占比例最高。逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠給予東莨菪堿藥物后,小鼠學(xué)習(xí)記憶功能、空間記憶能力等認(rèn)知功能均減弱,逃避潛伏期時(shí)間延長。陽性藥組、交泰丸中、高劑量組逃避潛伏期均明顯縮短,說明對于改善東莨菪堿模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能有明顯療效。低劑量組改善學(xué)習(xí)、記憶功能方面有療效,但并沒有達(dá)到中、高劑量的效果。從空間探索試驗(yàn)觀察小鼠的學(xué)習(xí)、空間記憶能力。模型組小鼠給予東莨菪堿藥物后,小鼠學(xué)習(xí)、空間記憶能力等認(rèn)知功能均減弱,穿越平臺次數(shù)減少。陽性藥組、交泰丸低、中、高劑量組穿越平臺次數(shù)增加,說明對于改善東莨菪堿模型小鼠的學(xué)習(xí)、空間記憶能力有明顯療效。在空間探索試驗(yàn)觀察小鼠記憶功能。模型組小鼠記憶、空間熟悉能力等認(rèn)知功能均減弱,空間探索試驗(yàn)在平臺象限停留時(shí)間減少。陽性藥組、交泰丸低、中、高劑量組空間探索試驗(yàn)在平臺象限停留時(shí)間增加,說明對于改善東莨菪堿模型小鼠的記憶功能具有療效。Y迷宮實(shí)驗(yàn)中,東莨菪堿模型組小鼠的自發(fā)性交替反應(yīng)百分?jǐn)?shù)與空白對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05,說明模型組小鼠的工作記憶功能低于空白對照組。安理申陽性藥組自發(fā)性交替反應(yīng)百分?jǐn)?shù)與模型組相對比,雖具有改善趨勢,但并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05,說明安理申多奈哌齊對于改善小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙有改善療效但不明顯。交泰丸低、中、高劑量組與模型組相比,自發(fā)性交替反應(yīng)百分?jǐn)?shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0.05,說明低、中、高劑量組對小鼠記憶認(rèn)知功能有改善作用。由此可見,在改善小鼠記憶功能方面,交泰丸低、中、高劑量改善小鼠記憶功能方面具有療效。新物體識別實(shí)驗(yàn)中,東莨菪堿模型組小鼠的對新事物識別指數(shù)與空白對照組相比具有下降趨勢,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。安理申陽性藥組新事物識別指數(shù)與模型組相對比沒有顯著性差異,但具有改善趨勢P0.05,說明安理申多奈哌齊改善小鼠對于新鮮事物的熟悉能力有改善趨勢,但并不明顯。交泰丸低、中、高劑量組與模型組相比,沒有顯著性差異,但具有改善趨勢P0.05,說明低、中、高劑量組改善小鼠對新鮮事物的熟悉能力具有改善作用。由此可見,交泰丸低、中、高劑量具有改善小鼠對新鮮事物識別記憶功能的能力。條件恐懼實(shí)驗(yàn)中,小鼠通過適應(yīng)期后,觀察測試東莨菪堿模型小鼠僵直次數(shù)與空白對照組相比有較顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.01,說明模型組小鼠對恐懼的記憶功能均明顯低于空白對照組。安理申陽性藥組與模型組的僵直次數(shù)相對比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.01,說明安理申多奈哌齊改善小鼠對于恐懼的記憶功能具有改善趨勢。交泰丸低、中、高劑量組與模型組相比,對于恐懼所產(chǎn)生的僵直次數(shù)有改變趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05,說明低、中、高劑量組改善對小鼠的恐懼記憶能力具有改善作用但不明顯。由此可見,在改善小鼠記憶功能方面,交泰丸低、中、高劑量具有改善小鼠記憶功能的作用。模型組小鼠給予東莨菪堿造模后,小鼠Ach水平減弱。陽性藥組、交泰丸低、中、高劑量組Ach水平升高,說明對于改善東莨菪堿模型小鼠的Ach水平有明顯療效。小鼠海馬皮質(zhì)AchE活性均升高。陽性藥組、交泰丸低、中、高劑量組小鼠皮質(zhì)海馬AchE活性下降,說明交泰丸組對于抑制東莨菪堿模型小鼠的AchE活性具有療效。小鼠ChAT活性減弱。陽性藥組、交泰丸低、中、高劑量組ChAT活性增加,說明對于改善東莨菪堿模型小鼠的ChAT活性有明顯療效。小鼠海馬皮質(zhì)MDA水平均升高。陽性藥組、交泰中、高劑量組小鼠皮質(zhì)海馬MDA水平下降,說明交泰丸組對于抑制東莨菪堿模型小鼠的MDA水平具有一定療效。小鼠海馬皮質(zhì)活性氧(ROS)水平均升高。陽性藥組、交泰丸組小鼠皮質(zhì)海馬活性氧(ROS)水平下降,說明交泰丸組對于抑制東莨菪堿模型小鼠的活性氧(ROS)水平有改善療效。小鼠海馬皮質(zhì)SOD活力均下降。陽性藥組、交泰低、中、高劑量組對改善小鼠皮質(zhì)海馬SOD活力均有升高,說明交泰丸組對于改善東莨菪堿模型小鼠的SOD活力具有治療作用。小鼠海馬皮質(zhì)CAT活力均下降。陽性藥組、交泰中、高劑量組對改善小鼠皮質(zhì)海馬CAT活力均有升高,說明交泰丸組在治療東莨菪堿模型小鼠的CAT活力方面具有改善作用。交泰丸低、中、高劑量組的BDNF、NGF、SYN、Psd95蛋白的表達(dá)均有改善趨勢,尼氏染色中東莨菪堿模型組小鼠的海馬CA1區(qū)細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)元明顯萎縮,不規(guī)則排列,染色微弱,提示神經(jīng)元受損擴(kuò)散或死亡,在這些神經(jīng)元中丟失了大量的尼氏體。交泰丸低劑量組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞神經(jīng)元部分顯示飽滿,排列較規(guī)則,染色正常,提示這部分神經(jīng)元少部分恢復(fù)。交泰丸中、高劑量組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞神經(jīng)元顯示較飽滿,排列較規(guī)則,染色正常,提示這部分神經(jīng)元部分恢復(fù)。交泰丸低、中、高劑量組對凋亡蛋白具有抑制作用,tunel染色陽性片呈深褐色,相比之下,東莨菪堿模型小鼠染色的切片,皮質(zhì)內(nèi)陽性細(xì)胞增多,背景深褐色加深。陽性藥物多奈哌齊組并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞深褐色出現(xiàn)。交泰丸低、中劑量均發(fā)現(xiàn)少量陽性細(xì)胞,但高劑量組并未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞。東莨菪堿模型組相比空白對照組小鼠的相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)、膽堿能指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、神經(jīng)元改善情況及凋亡蛋白情況均下降;陽性藥多奈哌齊組小鼠膽堿能指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、神經(jīng)元改善情況及凋亡蛋白情況相比模型組有所提高;交泰丸低、中、高劑量組與模型組相比較膽堿能指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、神經(jīng)元改善情況及凋亡蛋白情況有所改善。結(jié)論:交泰丸能改善小鼠學(xué)習(xí)、記憶、空間辨識、新物體識別、條件恐懼等行為學(xué)能力;交泰丸能改善小鼠Ach、AChE、ChAT等膽堿能系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo);交泰丸能改善小鼠MDA、ROS、SOD、CAT等氧化應(yīng)激系統(tǒng)指標(biāo);交泰丸改善小鼠神經(jīng)元BDNF,NGF,PSD95和SYN蛋白以及凋亡蛋白Bcl-2,Bax,Caspase-3蛋白的表達(dá)情況;交泰丸能改善小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)、染色、排列情況;交泰丸對小鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起到抑制和保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

論過圖 1 結(jié)果可以看出，我們所熬制的交泰丸制劑中主要含有八種有效成花堿（Magnoflorine）、格蘭地新（Groenlandicine）、黃連堿（Copti（Jatrorrhizine）、非洲防己堿（Columbamine）、小檗堿（Berberine）almatine）、桂皮醛（Cinnamaldehyde）。其中均含有黃連、肉桂的有效成

機(jī)制的研究25圖 3 小鼠 5 天逃避潛伏期游泳軌跡圖對比圖3．結(jié)論：從表 1，圖 2,3 中可以得出，東莨菪堿模型組小鼠的逃避潛伏期與空白對照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01，說明模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能均明顯低于空白對照組，造模成功。安理申陽性藥組逃避潛伏期與模型組相對比，雖具有改善趨勢，但并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，說明安理申多奈哌齊對于改善小鼠認(rèn)知功能障礙具有療效但并不明顯。交泰丸低劑量組與模型組相比，逃避潛伏期得到改善，但并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 P＞0.05。交泰丸中、高劑量與模型組相比較，逃避潛伏期有明顯改善，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。在改善東莨菪堿模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能方面，交泰丸中、高劑量更有療效。從以上結(jié)果可以看出，模型組小鼠給予東莨菪堿藥物后，小鼠學(xué)習(xí)記憶功能、空間記憶能力等認(rèn)知功能均減弱，逃避潛伏期時(shí)間延長。陽性藥組、交泰丸中、高劑量組逃避潛伏期均明顯縮短，說明對于改善東莨菪堿模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能有明顯療效。低劑量組改善學(xué)習(xí)、記憶功能方面有療效，但并沒有達(dá)到中、高劑量的效果。（二）空間探索試驗(yàn)1．測定方法空間探索試驗(yàn)則在定位航行試驗(yàn)結(jié)束后 24h 進(jìn)行，撤去平臺，選擇正南點(diǎn)將小鼠面朝池壁投入水中，讓其自由在水中游行 60s

注：模型組與正常組相比較*P＜0.05，**P＜0.0#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。3．結(jié)論由表 14，圖 16 可看出，東莨菪堿模型組白表達(dá)降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 P＜0.01。陽對比，BDNF 蛋白的表達(dá)升高，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差
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本文編號：2861833