發(fā)布時間：2020-10-26 09:13

　　 目的:本研究通過建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)對RAW264.7巨噬細胞的炎癥模型,探討蓮心堿的抗炎抗氧化活性及分子機制,在此基礎上,通過建立LPS誘導的小鼠急性肺損傷和佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)誘導的小鼠耳腫脹的動物模型,確證蓮心堿的抗炎抗氧化活性。方法:細胞實驗,我們采用LPS誘導RAW264.7細胞炎癥模型。首先使用CCK8法篩選蓮心堿的無細胞毒性濃度,流式細胞術(shù)(Flow Cytometry)檢測細胞中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量,分光光度法檢測細胞中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量,免疫印跡法(Western blot)法檢測抗氧化應激通路Nrf2/HO-1的蛋白水平;Griess法檢測一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的濃度,并利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測前列腺素2(ProstaglandinE2,PGE2)的濃度和促炎性細胞因子的水平、免疫印跡法檢測NF-κB and MAPKs炎性信號通路、熒光定量PCR檢測炎性基因環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和誘導性一氧化氮和酶(Inducible no synthase,iNOS)mRNA的表達;動物實驗,分別進行急性肺損傷和耳腫脹的動物模型,進一步確證蓮心堿的抗炎抗氧化活性。BALB/c小鼠隨機分為對照組、LPS組、LPS+蓮心堿(2 mg/kg、4mg/kg、8 mg/kg)組、地塞米松(5 mg/kg)組,鼻腔滴入法建立LPS誘導的急性肺損傷模型。12 h后,組織學觀察肺組織的病理學變化;ELISA檢測肺泡灌洗液(BALF)中腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的含量;Wright-Giemsa檢測BALF中中性粒細胞數(shù);BCA法檢測總蛋白含量;Evans Blue檢測肺毛細血管通透性;分光光度法檢測肺勻漿上清中髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)的活性、MDA的含量、SOD的活性、GSH的含量;流式細胞術(shù)檢測肺組織中ROS的含量。將40只ICR小鼠隨機分為空白組、模型組、蓮心堿(100μg/耳、300μg/耳、600μg/耳)組、地塞米松組,除空白組,其它各組涂抹TPA于小鼠右耳內(nèi)外側(cè),同時立即涂抹蓮心堿和地塞米松。6小時后,HE染色法觀察病理學改變,用數(shù)字測厚儀測量耳厚度,用打孔器(d=6mm)打孔取雙耳相同部位組織,以右耳重量/左耳重量計算腫脹指數(shù)。結(jié)果:細胞實驗結(jié)果顯示,蓮心堿在濃度為8和16μM時可體現(xiàn)出毒性,在0-4μM蓮心堿處理對細胞活力沒有任何影響,因此,本研究使用無毒濃度(0.5、1、2μM)的蓮心堿進行實驗。蓮心堿能夠明顯抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中ROS的產(chǎn)生,降低MDA的含量,提高SOD的活性和GSH的含量,降低炎性介質(zhì)NO和PGE2的含量,降低促炎細胞因子TNF-α,IL-6,IL-1β的含量;進一步蛋白檢測結(jié)果顯示,蓮心堿處理RAW264.7巨噬細胞后可使Keap1蛋白降解,釋放Nrf2,進入細胞核,促進HO-1蛋白表達,也可抑制IκBα的磷酸化和降解以及NF-κB p65的磷酸化,抑制p38、ERK1/2、JNK1/2的磷酸化,從而下調(diào)炎性基因i NOS和COX-2的mRNA表達。由此從分子機制說明蓮心堿的抗炎抗氧化活性。動物實驗結(jié)果顯示,蓮心堿能夠改善LPS誘導的小鼠ALI的炎性細胞浸潤,支氣管肺泡壁增厚和肺充血現(xiàn)象,降低BALF中促炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量、減少中性粒細胞數(shù)、肺勻漿中MPO的活性、BALF中蛋白的含量,降低肺微血管通透性,降低肺勻漿中MDA的含量、肺組織中ROS的含量,增加肺勻漿中SOD的活性和GSH的含量;蓮心堿能夠減輕TPA誘導的小鼠耳組織炎性細胞浸潤和耳腫脹現(xiàn)象,且降低TPA誘導的小鼠耳組織增厚和右耳重量/左耳重量比值。由此從動物水平證明蓮心堿的抗炎抗氧化活性。結(jié)論:本研究從分子機制上證實了蓮心堿對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞的抗氧化作用,進一步從細胞、分子機制上證實了蓮心堿對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞的抗炎作用,且從動物水平確證了蓮心堿對LPS誘導的小鼠急性肺損傷和TPA誘導的小鼠耳腫脹炎癥動物模型起到保護作用,為蓮心堿對炎性疾病的治療及研究提供了理論依據(jù)。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
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前言
第一部分 蓮心堿抗氧化作用及機制研究
    1 材料與方法
        1.1 實驗細胞
        1.2 藥品與試劑
        1.3 儀器
        1.4 實驗試劑的配制
        1.5 方法
        1.6 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果
        2.1 蓮心堿對RAW264.7巨噬細胞的毒性作用
        2.2 蓮心堿對LPS誘導的細胞中ROS含量的影響
        2.3 蓮心堿對LPS誘導的氧化指標的影響
        2.4 蓮心堿對LPS誘導的Nrf2/HO-1的蛋白表達水平的影響
    3 討論
    4 結(jié)論
第二部分 蓮心堿抗炎作用及機制研究
    1 材料與方法
        1.1 實驗細胞
        1.2 藥品與試劑
        1.3 儀器
        1.4 方法
        1.5 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果
        2.1 蓮心堿對LPS誘導的炎性介質(zhì)NO,PGE2含量的影響
        2.2 蓮心堿對LPS誘導的TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響
        2.3 蓮心堿對LPS誘導的COX-2和iNOSmRNA表達水平的影響
        2.4 蓮心堿對LPS誘導的NF-κB和MAPKs蛋白表達水平的影響
    3 討論
    4 結(jié)論
第三部分 蓮心堿對LPS誘導的急性肺損傷保護作用及機制研究
    1 材料與方法
        1.1 實驗動物
        1.2 藥品與試劑
        1.3 儀器
        1.4 方法
        1.5 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果
        2.1 蓮心堿對小鼠急性肺損傷的病理學的影響
        2.2 蓮心堿對BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響
        2.3 蓮心堿對細胞計數(shù)和MPO活性的影響
        2.4 蓮心堿對BALF中的蛋白濃度和肺毛細血管通透性的影響
        2.5 蓮心堿對MDA含量、SOD活性、GSH含量和ROS水平的影響
    3 討論
    4 結(jié)論
第四部分 蓮心堿對TPA誘導小鼠耳腫脹的抗炎作用研究
    1 材料與方法
        1.1 實驗動物
        1.2 藥品與試劑
        1.3 儀器
        1.4 方法
        1.5 統(tǒng)計分析
    2 結(jié)果
        2.1 蓮心堿對小鼠耳腫脹的病理學的影響
        2.2 蓮心堿對耳厚度和耳腫脹指標的影響
    3 討論
    4 結(jié)論
參考文獻
綜述
    參考文獻
致謝
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個人簡歷

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本文編號：2856802