目的傳統(tǒng)中藥物質(zhì)成分復(fù)雜,質(zhì)量難于控制,藥效物質(zhì)作用機制難以證明是目前中藥國際化的重大難題。隨著現(xiàn)代中藥的發(fā)展進(jìn)程,以“物質(zhì)基礎(chǔ)基本清楚”、“作用機制基本清楚”為原則的組分中藥研究成為新的熱點,并己初步建立了“標(biāo)準(zhǔn)組分、組效關(guān)系、組分配伍、優(yōu)化設(shè)計”的組分中藥研發(fā)模式。前期研究結(jié)果證實,葒草苷具有一定的抗心肌缺血缺氧/復(fù)氧損傷作用,本研究以葒草苷為關(guān)鍵成分進(jìn)行組分設(shè)計,探尋“試驗設(shè)計-建立模型-多目標(biāo)優(yōu)化”的組分優(yōu)化方法,探究“以葒草苷為關(guān)鍵成分的組合藥物比單個成分在心肌缺氧/復(fù)氧模型上的保護作用更好,且組合藥物抗MIRI作用機制與調(diào)控自噬相關(guān)”的假說,為組分優(yōu)化研究提供方法學(xué)上的參考及實驗依據(jù)。方法與結(jié)果1.篩選進(jìn)入組分優(yōu)化的成分首先,研究前期對含葒草苷的植物的調(diào)研,通過約束成分篩選條件:①黃酮類成分;②與葒草苷共同存在在同一植物中;③有抗氧化、抗炎等相關(guān)藥理作用研究報道。據(jù)此初步選出槲皮苷、牡荊素、槲皮素、木犀草素、異葒草素五個成分。第二步,采用CCK-8法檢測各成分對H9c2細(xì)胞存活率的影響。第三步,采用三氣培養(yǎng)箱混合氣體法建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型,通過CCK-8法和LDH法研究各成分對H9c2缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞存活率、損傷率的影響。實驗結(jié)果提示:葒草苷(0～200 μM),槲皮苷(0～200 μM),牡荊素(0～80μM),異葒草苷(0～200μM)孵育36 h內(nèi)對H9c2細(xì)胞增殖無明顯影響;除異葒草苷外,葒草苷、槲皮苷、牡荊素均能顯著性下調(diào)細(xì)胞損傷率。因此,葒草苷(0～50μM)、槲皮苷(0～40μM)、牡荊素(0～24μM)為最適合后續(xù)均勻試驗設(shè)計的組分及濃度范圍。2.基于“UD-SR-SA”法的組分優(yōu)化方法研究及其實驗驗證本實驗通過均勻設(shè)計得到葒草苷、槲皮苷、牡荊素的不同配比組合,通過藥效學(xué)實驗分別進(jìn)行檢測:①利用CCK-8法檢測各配比對H9c2缺氧/復(fù)氧損傷模型細(xì)胞存活率的影響;②采用LDH法檢測細(xì)胞損傷率;③檢測培養(yǎng)基中NO含量。基于上述藥效學(xué)實驗結(jié)果,利用R語言建立逐步回歸模型,得到綜合藥效與葒草苷、槲皮苷、牡荊素給藥劑量之間的三元二次方程式�；谀M退火算法理論,用python編程解出當(dāng)綜合藥效最佳時各成分的給藥濃度,即最佳配比組合OQV-e。最后,對OQV-e進(jìn)行藥效學(xué)實驗驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn):最佳配比組合能顯著提高H9c2心肌細(xì)胞存活率,降低細(xì)胞損傷率,降低NO含量,且最佳配比組合比葒草苷、槲皮苷、牡荊素單個成分降低細(xì)胞損傷率效果更明顯(P0.05),說明相較于單個成分,最佳配比組合表現(xiàn)出更優(yōu)異的抗MIRI藥效。3.OQV-e對H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用機制探討通過光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),最佳配比組能明顯改善受損的H9c2細(xì)胞狀態(tài)。通過Western Blot法檢測H9c2細(xì)胞內(nèi)LC3、Beclin 1、p-JNK、JNK、的蛋白表達(dá)水平,評價最佳配比對缺氧/復(fù)氧損傷H9c2細(xì)胞內(nèi)JNK通路及細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與模型組相比,最佳配比組p-JNK/JNK的比值降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著性降低,Beclin 1的表達(dá)水平明顯升高(P0.05),說明最佳配比組合能夠抑制JNK信號通路,抑制過度自噬,進(jìn)而達(dá)到保護缺氧/復(fù)氧損傷心肌的目的。結(jié)論:1.結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研與初步藥效實驗結(jié)果,選擇葒草苷、槲皮苷、牡荊素進(jìn)行組合藥物設(shè)計;2.采用均勻設(shè)計為試驗設(shè)計方法,以H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷為實驗研究模型,逐步回歸分析為建模準(zhǔn)則,模擬退火算法為計算理論,計算出最佳配比組合OQV-e,即葒草苷12.55 μM、槲皮苷39.99μM、牡荊素19.223.3.OQV-e抗MIRI的良好藥效可能是通過抑制JNK信號通路,抑制過度自噬,進(jìn)而達(dá)到保護缺氧/復(fù)氧損傷心肌的目的。
【學(xué)位單位】：中央民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R284;R285
【部分圖文】：

心肌缺血再灌注過程所涉及的機制通常認(rèn)為有：活性氧自由基（ｒｅａｃｔｉｖｅ??ｏｘｙｇｅｎ?ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）的作用、細(xì)胞內(nèi)媽超載、線粒體膜電位崩解、細(xì)胞凋亡與??自噬、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等［１（）］。如圖１－１所示，在心肌再灌注過程中，生理??Ｉｓｃｈｅｍｉｃ?Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ??－３?Ｉｎｊｕｒｙ??Ｏｖｅｒｌｏａｄ?Ｊ?３?Ｉ?Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ?；?．??ＰＴＰ?Ｏｐｅｎｉｎｇ?］??ＴＬＲ４?Ｓ?ＴＬＲ２??圖１－１缺血再灌注損傷過程［１４］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｉｓｃｈｅｍｉａ?ｒｅｐｅｒｆｌｉｓｉｏｎ?ｉｎｊｕｒｙ??ｐＨ值的快速恢復(fù)導(dǎo)致Ｃａ＞超載，并使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ??ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ?ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ?ｐｏｒｅ，ｍＰＴＰ）開放，導(dǎo)致?Ｒ０Ｓ?大量生成。ＲＯＳ?的堆積使炎??癥因子如ＴＮＦ－ｏｔ，?ＮＦ－Ｋｂ，ＩＬ－６等進(jìn)一步增強白細(xì)胞浸潤、細(xì)胞黏附分子表達(dá)，??引起嗜中性粒細(xì)胞的入侵［１１］。??導(dǎo)致Ｍ１ＲＩ損傷的最重要原因是氧化應(yīng)激反應(yīng)。在正常情況下，身體產(chǎn)生的??Ｒ０Ｓ可通過內(nèi)源性機制清除。但當(dāng)內(nèi)源性清除功能障礙、自由基大量過剩時，??則會引起Ｒ０Ｓ在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，進(jìn)而引起組織損傷［１２］。當(dāng)心肌細(xì)胞缺血、缺氧??時，內(nèi)源性清除系統(tǒng)功能（清除Ｒ０Ｓ功能）降低或喪失，但其生成系統(tǒng)活性增??強；當(dāng)恢復(fù)血液和氧氣供應(yīng)時

＾?ｗｍｔ?丨?４??１?＾??＇?ｍｍ?ｃｌ＾，??Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ??圖１－２缺血再灌注過程中分子轉(zhuǎn)錄機制［１９］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ?ｄｕｒｉｎｇ?ｉｓｃｈｅｍｉａ?ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ??另有研究表明，Ｎ？可以通過抑制ＪＮＫ信號通路來減少自噬。ＪＮＫ信號通??路增強會導(dǎo)致不同類型的細(xì)胞凋亡，其主要機制之一是磷酸化Ｂｃｌ－２并將其與??Ｂｅｃｌｉｎ－１分離［２５’２６］。ＪＮＫ是一種蛋白激酶，磷酸化后的ｐ－ＪＮＫ可誘導(dǎo)自噬，是??ＭＡＰＫｓ中重要的通路之一，也有研究表明ＪＮＫ及磷酸化ＪＮＫ是ＮＯ參與抑制??自噬的潛在機制［２７］。如圖１－３所示為ＭＡＰＫ－ＪＮＫ信號通路參與自噬調(diào)控的重要??機制圖。被激活的ＪＮＫ１導(dǎo)致氨基酸殘基（Ｔｈｒ６９、Ｓｅｒ７０和Ｓｅｒ８７）上的Ｂｃｌ－２磷酸??化，將Ｂｃｌ－２與Ｂｅｃｌｉｎｌ分離，形成Ｂｅｃｌｉｎｌ相關(guān)的ＰＩ３Ｋ?ＩＩＩ復(fù)合物，從而調(diào)控自??噬。Ｂｅｃｌｉｎｌ相關(guān)的ＰＩ３Ｋ?ＩＩＩ復(fù)合物蛋白在自噬的不同階段發(fā)揮刺激或抑制作用，??ＪＮＫ被激活后磷酸化，從而激活ｃ－Ｊｕｎ／ｃ－Ｆｏｓ，增強其對Ｂｅｄｉｎｌ的轉(zhuǎn)錄活性。激??活ＪＮＫ還可以誘導(dǎo)ＦｏｘＯｓ核定位

趕草苷（Ｏｒｉｅｎｔｉｎ）、槲皮苷（Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ?）、牡荊素（Ｖｉｔｅｘｉｎ?）、槲皮素（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ?）、??木犀草素（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、異趕草素（Ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）均為黃酮類單體化合物，其結(jié)構(gòu)??如圖２－１。??葒草苷是苗藥都木油的主要化學(xué)成分。苗醫(yī)常采用都木油單方或復(fù)方治療胸??口悶脹痛等“毒”性病癥［８４］，苗藥都木油因其解毒、利濕、止血等功效，有“萬能??解毒藥”之稱［８５］�，F(xiàn)代藥理研究表明，葒草苷具有保護心血管、抗衰老、抗腫瘤、??抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌、保護神經(jīng)等多種藥理作用［５９］。槲皮苷具有抗氧化、??抗腫瘤、降血糖、降血脂、擴張冠脈、抗心律失常、等多種藥理作用［８２］；牡荊??素生物活性廣泛，具有腦保護、心肌保護、骨保護、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗??菌、降壓、解痙以及治療糖尿病、甲狀腺疾病等多種藥理作用［８＜）］：木犀草素具??有心臟保護、抗腫瘤、抑菌、抗病毒、降血脂血糖、抗纖維化、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫??調(diào)節(jié)等藥理作用［７９］；異葒草苷具有抗氧化、抗炎、改善胰島素抵抗、弱化肝纖??維化發(fā)展以及誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡等藥理作用［８３］；槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、??抗感染、免疫抑制、心血管保護、血糖調(diào)節(jié)等多種藥理作用［８１］。??這六種黃酮類單體的藥理作用有同有異，藥理作用機制互有交疊。本章以葒??草苷、異葒草苷、牡荊素、槲皮素、槲皮苷、木犀草素六種成分為研究對象，通??過Ｈ９ｃ２細(xì)胞毒性實驗、缺氧／復(fù)氧損傷的藥效學(xué)評價實驗，為后續(xù)組分配比優(yōu)化??試驗設(shè)計奠定基礎(chǔ)。??１５??
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本文編號：2856256