該研究基于中藥質(zhì)量標志物(Q-marker)理論以丹參為研究對象,對丹參毛狀根進行誘導(dǎo)實驗,采用實時熒光定量PCR檢測毛狀根中SmCPS,SmKSL,CYP76AH1 3條基因的相對表達量;分別采用UPLC和GC-MS技術(shù)檢測毛狀根與藥材中丹參酮Ⅱ_A、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、1,2-二氫丹參酮、鐵銹醇以及次丹參酮二烯的含量;統(tǒng)計學(xué)分析表明:丹參毛狀根中次丹參酮二烯與鐵銹醇的含量與下游丹參酮類化合物的含量存在正相關(guān),且丹參酮類化合物生源途徑上重要基因的相對表達量可在一定程度上反映丹參酮類化合物的含量;在多省份丹參藥材中,初步發(fā)現(xiàn)鐵銹醇與丹參酮類化合物的含量也存在正相關(guān)。該研究從丹參毛狀根體系可控實驗入手,結(jié)合丹參藥材,以丹參中特有指標性成分丹參酮類化合物的生源途徑為研究基礎(chǔ),突出了生源途徑上游基因、中游中間體化合物與下游丹參酮類化合物含量之間的重要關(guān)系,進而為從生源途徑方面理解和研究丹參質(zhì)量標志物(Q-marker)提供了可能的研究思路,以期建立多元、完整的中藥丹參的質(zhì)量控制體系。
【部分圖文】：

丹參酮類化合物是由所有二萜的共同前體GGPP(牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸)經(jīng)過多步生物合成反應(yīng)生成。已知丹參酮類化合物生源途徑見圖1,次丹參酮二烯(miltiradiene)是形成丹參酮類化合物骨架的第一步,鐵銹醇(ferruginol)是第一個CYP450酶修飾生成的化合物,故這2個化合物為丹參酮類化合物生物合成途徑上的重要中間體化合物[12-16]。本研究基于中藥質(zhì)量標志物(Q-marker)理論,結(jié)合藥材質(zhì)量的可控性與溯源性,從丹參中特有活性成分丹參酮類化合物的生源途徑出發(fā),探究丹參酮類化合物含量與其上游基因表達量、中間體化合物(鐵銹醇,次丹參酮二烯)含量的潛在關(guān)系,從而以新的思路探究中藥丹參的質(zhì)量控制體系,為完善多元化丹參質(zhì)量標志物體系提供新的的研究思路。

根據(jù)實時熒光定量PCR原始檢測結(jié)果,按照2-ΔΔCt相對定量計算公式,以誘導(dǎo)0 h的毛狀根為對照,計算各樣品目的基因相對定量結(jié)果,見圖2。采用SPSS 21軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,使用LSD-t檢驗驗證誘導(dǎo)前后基因表達量的顯著性差異,默認α=0.05,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。誘導(dǎo)子可以提高以上3種基因的表達量,且在誘導(dǎo)24 h時表達量到達峰值。

分析丹參毛狀根誘導(dǎo)組次丹參酮二烯、鐵銹醇與總丹參酮含量和非誘導(dǎo)組次丹參酮二烯、鐵銹醇與總丹參酮含量,均具有正態(tài)性,故采用Pearson 相關(guān)性分析。誘導(dǎo)組總丹參酮含量與鐵銹醇含量相關(guān)系數(shù)為0.830(P<0.01);非誘導(dǎo)組總丹參酮含量與中間體鐵銹醇含量相關(guān)系數(shù)為0.577(P<0.01)。誘導(dǎo)組總丹參酮含量與次丹參酮二烯含量相關(guān)系數(shù)為0.509(P<0.01);非誘導(dǎo)組總丹參酮含量與次丹參酮二烯含量相關(guān)系數(shù)為0.543(P<0.01)。圖4 各省份鐵銹醇與丹參酮含量(n=3)
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