目的:(1)獲得具有降解馬兜鈴酸I(aristolochic acid I,AAI)的微生物資源,選擇最優(yōu)菌株進(jìn)一步分析鑒定;(2)探索AAI致腎損傷的分子機(jī)制,篩選出有潛力的AAI腎毒性分子標(biāo)志物;(3)將獲得的降解菌株應(yīng)用于AAI含量較高的青木香進(jìn)行發(fā)酵炮制,再結(jié)合本研究中篩選得到的分子標(biāo)志物對(duì)其腎毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法:本課題一方面運(yùn)用微生物純培養(yǎng)技術(shù)從含馬兜鈴酸植物的根際土壤中分離純化出了多株能夠降解AAⅠ的細(xì)菌菌株,比較了這些菌株的降解能力后,選取了降解能力最高的菌株進(jìn)行分子鑒定,并測(cè)定其全基因組序列,進(jìn)行比較基因組分析。另一方面,通過(guò)采集NCBI、TCGA中現(xiàn)有的AAⅠ動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)及原發(fā)性腎癌的測(cè)序數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)分析AAⅠ引起的腎臟基因表達(dá)的改變,然后對(duì)相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析及信號(hào)通路分析以闡明AAⅠ致腎損傷的分子機(jī)制;再結(jié)合原發(fā)性腎癌的分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì),從而篩選出有潛力的AAⅠ腎毒性分子標(biāo)志物并進(jìn)行驗(yàn)證。最后,我們用降解能力最高的菌株對(duì)含AAⅠ的藥材進(jìn)行發(fā)酵,并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),再結(jié)合本研究中篩選得到的分子標(biāo)志物對(duì)其毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果:(1)從馬兜鈴根際土壤中獲得33株純培養(yǎng)菌株,經(jīng)驗(yàn)證其中11株對(duì)AAⅠ有著不同降解能力,最高可在非優(yōu)化條件下48h降解85.36%;從樟樹根際獲得6株純培養(yǎng)菌株,后期驗(yàn)證均不能降解AAⅠ。(2)用PCR技術(shù)對(duì)降解能力最強(qiáng)的菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行了擴(kuò)增,并測(cè)序;基于16S rRNA基因序列進(jìn)行分子鑒定,得出該菌株為Sphingobium屬的一個(gè)潛在新種,暫命名為Sphingobium sp.AA3。(3)對(duì)Sphingobium sp.AA3的500×基因組二代測(cè)序質(zhì)量較好,最終組裝形成了78個(gè)contigs,基因組總大小為5,538,228 bps。該菌株基因組與其近緣菌株基因組之間差距較大,支持該菌株為Sphingobium屬的新種。Sphingobium sp.AA3基因組中包含5,663個(gè)基因,其中5,581個(gè)基因是編碼基因,其中73%得到了功能注釋。被注釋的基因中有近1/3為代謝相關(guān)蛋白,其中有多個(gè)基因可能與芳香族化合物的降解有關(guān)。(4)AAI引起代謝途徑基因表達(dá)改變,并表現(xiàn)出與原發(fā)性腎癌相似的Warburg效應(yīng);AAI和原發(fā)性腎癌均上調(diào)PI3K途徑,但是通過(guò)上調(diào)不同的PI3K通路蛋白實(shí)現(xiàn);AAI同時(shí)表現(xiàn)出上調(diào)細(xì)胞凋亡和壞死途徑的復(fù)雜屬性;多個(gè)基因在馬兜鈴酸腎病和原發(fā)性腎癌中的表達(dá)模式一致,部分基因與腎癌病人的生存與預(yù)后密切相關(guān)。(5)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,AAI導(dǎo)致了Acad11、Enpep的下調(diào)以及PANX2、WNT7B的上調(diào),這與原發(fā)性腎癌中基因的異常表達(dá)模式是一致的;同時(shí)AAI也引發(fā)了Prima1的下調(diào)以及Cdkn1a的上調(diào),而這是與原發(fā)性腎癌有區(qū)別的,因而有可能是AAI腎毒性的分子標(biāo)志物。(6)經(jīng)HPLC檢測(cè),Sphingobium sp.AA3能有效降解青木香水煎劑中的馬兜鈴酸I,降解率超過(guò)90%。(7)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,青木香水煎劑和馬兜鈴酸標(biāo)準(zhǔn)溶液灌胃小鼠可造成小鼠的腎臟外形的明顯改變,以及Prima1、Wnt7b、Cdkn1a相應(yīng)的表達(dá)變化;而Sphingobium sp.AA3青木香水煎劑的發(fā)酵液結(jié)果則幾乎與生理鹽水對(duì)照組相似,提示利用Sphingobium sp.AA3發(fā)酵具有控制大劑量青木香水煎劑的急性腎毒性作用的可能性。結(jié)論:馬兜鈴的根際土壤中存在著利用馬兜鈴酸Ⅰ的菌株,本課題所獲得的菌株中以AA3的降解能力最強(qiáng),經(jīng)鑒定為Sphingobium屬,并用二代測(cè)序技術(shù)測(cè)定了全基因組序列,分析了其遺傳信息背景,以便于后續(xù)進(jìn)一步研究分析。對(duì)NCBI、TCGA中現(xiàn)有的AAⅠ動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)合原發(fā)性腎癌的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行的系列分析和定量PCR驗(yàn)證,篩選了Prima1、Acad11、Enpep、Epha2、Psmb8、Bcl3、Axl、Hgfac、Cd276、Mmp2、PANX2、WNT7B、Cdkn1a等13個(gè)有潛力的AAⅠ腎毒性分子標(biāo)志物。用降解能力最高的Sphingobium sp.AA3對(duì)AAⅠ含量較高的青木香進(jìn)行發(fā)酵,并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),再結(jié)合本研究中篩選得到的分子標(biāo)志物對(duì)其毒性進(jìn)行評(píng)價(jià),獲得了較為理想的效果。
【學(xué)位單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

馬兜鈴酸降解菌和腎毒性分子標(biāo)志物的篩選及應(yīng)用察了各菌株在 King’s B 上產(chǎn)熒光色素的情況基中的磷酸鹽可促進(jìn)熒光素的產(chǎn)生，硫酸鎂為離子，該培養(yǎng)基用于觀察細(xì)菌產(chǎn)熒光色素的情下是可見色素。并對(duì)部分菌株用掃描電鏡進(jìn)行 1.2。

菌株的掃描電鏡照片

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆博士學(xué)位論文AAⅠ含量測(cè)定最佳波長(zhǎng)的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制梯度濃度的馬兜鈴酸Ⅰ的基本無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基溶液λ=318nm 為最佳測(cè)定波長(zhǎng)。繼而以不含馬兜鈴酸溶液為空白對(duì)照，測(cè)定各濃度樣品的 OD318值。以坐標(biāo)，OD318值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖 1.2）， y=0.0036x-0.0017，相關(guān)系數(shù)為 R2=0.9991，說(shuō)明中的馬兜鈴酸Ⅰ濃度與其 OD318值之間有著良好的
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本文編號(hào)：2855787