目的:(1)獲得具有降解馬兜鈴酸I(aristolochic acid I,AAI)的微生物資源,選擇最優(yōu)菌株進一步分析鑒定;(2)探索AAI致腎損傷的分子機制,篩選出有潛力的AAI腎毒性分子標志物;(3)將獲得的降解菌株應用于AAI含量較高的青木香進行發(fā)酵炮制,再結合本研究中篩選得到的分子標志物對其腎毒性進行評價。方法:本課題一方面運用微生物純培養(yǎng)技術從含馬兜鈴酸植物的根際土壤中分離純化出了多株能夠降解AAⅠ的細菌菌株,比較了這些菌株的降解能力后,選取了降解能力最高的菌株進行分子鑒定,并測定其全基因組序列,進行比較基因組分析。另一方面,通過采集NCBI、TCGA中現(xiàn)有的AAⅠ動物實驗測序數(shù)據(jù)及原發(fā)性腎癌的測序數(shù)據(jù),統(tǒng)計分析AAⅠ引起的腎臟基因表達的改變,然后對相關差異表達基因進行富集分析及信號通路分析以闡明AAⅠ致腎損傷的分子機制;再結合原發(fā)性腎癌的分析結果進行比對,從而篩選出有潛力的AAⅠ腎毒性分子標志物并進行驗證。最后,我們用降解能力最高的菌株對含AAⅠ的藥材進行發(fā)酵,并進行動物實驗,再結合本研究中篩選得到的分子標志物對其毒性進行評價。結果:(1)從馬兜鈴根際土壤中獲得33株純培養(yǎng)菌株,經(jīng)驗證其中11株對AAⅠ有著不同降解能力,最高可在非優(yōu)化條件下48h降解85.36%;從樟樹根際獲得6株純培養(yǎng)菌株,后期驗證均不能降解AAⅠ。(2)用PCR技術對降解能力最強的菌株16S rRNA基因序列進行了擴增,并測序;基于16S rRNA基因序列進行分子鑒定,得出該菌株為Sphingobium屬的一個潛在新種,暫命名為Sphingobium sp.AA3。(3)對Sphingobium sp.AA3的500×基因組二代測序質量較好,最終組裝形成了78個contigs,基因組總大小為5,538,228 bps。該菌株基因組與其近緣菌株基因組之間差距較大,支持該菌株為Sphingobium屬的新種。Sphingobium sp.AA3基因組中包含5,663個基因,其中5,581個基因是編碼基因,其中73%得到了功能注釋。被注釋的基因中有近1/3為代謝相關蛋白,其中有多個基因可能與芳香族化合物的降解有關。(4)AAI引起代謝途徑基因表達改變,并表現(xiàn)出與原發(fā)性腎癌相似的Warburg效應;AAI和原發(fā)性腎癌均上調PI3K途徑,但是通過上調不同的PI3K通路蛋白實現(xiàn);AAI同時表現(xiàn)出上調細胞凋亡和壞死途徑的復雜屬性;多個基因在馬兜鈴酸腎病和原發(fā)性腎癌中的表達模式一致,部分基因與腎癌病人的生存與預后密切相關。(5)動物實驗結果證明,AAI導致了Acad11、Enpep的下調以及PANX2、WNT7B的上調,這與原發(fā)性腎癌中基因的異常表達模式是一致的;同時AAI也引發(fā)了Prima1的下調以及Cdkn1a的上調,而這是與原發(fā)性腎癌有區(qū)別的,因而有可能是AAI腎毒性的分子標志物。(6)經(jīng)HPLC檢測,Sphingobium sp.AA3能有效降解青木香水煎劑中的馬兜鈴酸I,降解率超過90%。(7)動物實驗結果表明,青木香水煎劑和馬兜鈴酸標準溶液灌胃小鼠可造成小鼠的腎臟外形的明顯改變,以及Prima1、Wnt7b、Cdkn1a相應的表達變化;而Sphingobium sp.AA3青木香水煎劑的發(fā)酵液結果則幾乎與生理鹽水對照組相似,提示利用Sphingobium sp.AA3發(fā)酵具有控制大劑量青木香水煎劑的急性腎毒性作用的可能性。結論:馬兜鈴的根際土壤中存在著利用馬兜鈴酸Ⅰ的菌株,本課題所獲得的菌株中以AA3的降解能力最強,經(jīng)鑒定為Sphingobium屬,并用二代測序技術測定了全基因組序列,分析了其遺傳信息背景,以便于后續(xù)進一步研究分析。對NCBI、TCGA中現(xiàn)有的AAⅠ動物實驗測序數(shù)據(jù)結合原發(fā)性腎癌的測序數(shù)據(jù)進行的系列分析和定量PCR驗證,篩選了Prima1、Acad11、Enpep、Epha2、Psmb8、Bcl3、Axl、Hgfac、Cd276、Mmp2、PANX2、WNT7B、Cdkn1a等13個有潛力的AAⅠ腎毒性分子標志物。用降解能力最高的Sphingobium sp.AA3對AAⅠ含量較高的青木香進行發(fā)酵,并進行動物實驗,再結合本研究中篩選得到的分子標志物對其毒性進行評價,獲得了較為理想的效果。
【學位單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

馬兜鈴酸降解菌和腎毒性分子標志物的篩選及應用察了各菌株在 King’s B 上產(chǎn)熒光色素的情況基中的磷酸鹽可促進熒光素的產(chǎn)生，硫酸鎂為離子，該培養(yǎng)基用于觀察細菌產(chǎn)熒光色素的情下是可見色素。并對部分菌株用掃描電鏡進行 1.2。

菌株的掃描電鏡照片

湖北中醫(yī)藥大學 2019 屆博士學位論文AAⅠ含量測定最佳波長的確定及標準曲線的繪制梯度濃度的馬兜鈴酸Ⅰ的基本無機鹽培養(yǎng)基溶液λ=318nm 為最佳測定波長。繼而以不含馬兜鈴酸溶液為空白對照，測定各濃度樣品的 OD318值。以坐標，OD318值為縱坐標繪制標準曲線（圖 1.2）， y=0.0036x-0.0017，相關系數(shù)為 R2=0.9991，說明中的馬兜鈴酸Ⅰ濃度與其 OD318值之間有著良好的
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本文編號：2855787