目的:1.探討水飛薊賓對臨床常見感染細(xì)菌的體外抑菌活性及抑菌譜。2.探討水飛薊賓與臨床常用抗菌素的聯(lián)合作用。3.研究水飛薊賓的抑菌機(jī)制。為開發(fā)新型抗菌藥物提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.水飛薊賓的抑菌活性檢測(1)采用微量肉湯稀釋法測定水飛薊賓及其同分異構(gòu)體(異水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭)對臨床常見感染細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌)標(biāo)準(zhǔn)菌株的最低抑菌濃度(MIC)。平行測定3次,取平均值。(2)采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定不同濃度水飛薊賓對臨床常見感染細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株生長曲線的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(3)采用微量肉湯稀釋法測定水飛薊賓對常見感染細(xì)菌臨床分離菌株的最低抑菌濃度(MIC)。平行測定3次,取平均值。(4)采用棋盤微量肉湯稀釋法進(jìn)行水飛薊賓與臨床常用抗菌素(革蘭陽性菌選用青霉素和紅霉素,革蘭陰性菌選用慶大霉素和環(huán)丙沙星)聯(lián)合藥敏試驗(yàn),測定在聯(lián)合用藥的情況下,水飛薊賓對細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)及抗菌素對細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC),并計(jì)算聯(lián)合抑菌指數(shù)(FIC)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.水飛薊賓的抑菌機(jī)制研究(1)水飛薊賓對表皮葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的影響:1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別在37℃作用細(xì)菌0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、5 h、7 h和9 h(對照組用無菌水代替水飛薊賓)后取樣,使用考馬斯亮蘭-分光光度法分別檢測各作用時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌培養(yǎng)液中胞外蛋白濃度(平行測3次),繪制蛋白濃度—作用時(shí)間曲線,并比較實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異性。(2)水飛薊賓對表皮葡萄球菌菌體蛋白代謝的影響:1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別在37℃作用細(xì)菌12 h(對照組用無菌水代替水飛薊賓)后,將各菌懸液稀釋到相同濃度(相同OD值),取等體積離心,制備菌體可溶性蛋白,然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,對凝膠圖譜進(jìn)行拍照分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。(3)水飛薊賓對表皮葡萄球菌核酸代謝的影響:1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別在37℃作用細(xì)菌6 h、12 h、24 h和48 h(對照組用無菌水代替水飛薊賓)后取樣,將各菌懸液稀釋到相同濃度(相同OD值)后,各取等體積的量與DAPI染液反應(yīng),然后于熒光分光光度計(jì)上分別測定菌體的DNA熒光強(qiáng)度和RNA熒光強(qiáng)度(平行測3次),并采用SPSS 21.0對二者結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)水飛薊賓對表皮葡萄球菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的影響:pBR322 DNA主要以超螺旋形式(FormⅠ)存在,而拓?fù)洚悩?gòu)酶可以將pBR322 DNA超螺旋形式解旋為開環(huán)或線性DNA(FormⅡ)。1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別于37℃對細(xì)菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和pBR322 DNA混合物作用30 min(對照組用DMSO代替水飛薊賓)后,通過凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)觀察pBR322 DNA存在的形式,獲得水飛薊賓對表皮葡萄球菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(5)水飛薊賓對表皮葡萄球菌生物膜的影響:用1 MBIC和2 MBIC水飛薊賓分別作用于各階段(6 h、24 h和48 h)的生物膜,于37℃培養(yǎng)過夜。然后,用結(jié)晶紫染色法對生物膜進(jìn)行半定量測定,運(yùn)用SPSS 21.0對吸光度值進(jìn)行單因素方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;最后用激光共聚焦技術(shù)直接觀察水飛薊賓對生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。結(jié)果:1.水飛薊賓的抑菌活性(1)水飛薊賓對革蘭陽性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的最小抑菌濃度(MIC)范圍為50-400μg/mL,其中對表皮葡萄球菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑菌活性,MIC值為50μg/mL,而該藥對革蘭陰性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC值范圍為400μg/mL;在水飛薊賓的同分異構(gòu)體中,異水飛薊賓對表皮葡萄球菌、屎腸球菌和糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC均為400μg/mL,其他同分異構(gòu)體對臨床常見感染細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值均400μg/mL。(2)水飛薊賓對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌生長曲線有明顯的抑制作用,且隨著藥物濃度的增加,抑制效果越顯著,而該藥對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的生長曲線沒有任何影響。(3)水飛薊賓對臨床分離革蘭陽性菌株的MIC值:表皮葡萄球菌為≥100μg/mL,金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌均為≥400μg/mL;水飛薊賓對臨床分離革蘭陰性菌株的MIC值均400μg/mL。(4)在聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中,對于革蘭陽性菌,水飛薊賓與青霉素/紅霉素的聯(lián)合抑菌指數(shù)均以0.5FIC≤1和1FIC≤2為主,沒有FIC≤0.5和FIC2;對于革蘭陰性菌,水飛薊賓與環(huán)丙沙星的聯(lián)合抑菌指數(shù)均以FIC2為主,1FIC≤2較少,沒有FIC≤0.5和0.5FIC≤1。水飛薊賓與慶大霉素的聯(lián)合抑菌指數(shù)均以1FIC≤2為主,FIC2較少,沒有FIC≤0.5和0.5FIC≤1。2.水飛薊賓的抑菌機(jī)制(1)在不同作用時(shí)間,藥物組與對照組的細(xì)菌培養(yǎng)上清液中可溶性蛋白濃度都無顯著性差異(p0.05)。(2)與對照組比較,藥物組菌體可溶性蛋白電泳圖譜條帶更細(xì)、更淺,甚至缺如。受1 MIC和2 MIC水飛薊賓作用的細(xì)菌,63 kD-75 kD之間以及17 KD以下的條帶均消失。(3)與對照組比較,受1 MIC和2 MIC水飛薊賓作用的細(xì)菌DNA熒光強(qiáng)度分別降低16%及21%以上(p0.05),受1 MIC和2 MIC水飛薊賓作用的細(xì)菌RNA熒光強(qiáng)度分別降低15%及21%以上(p0.05)。(4)與1 U拓?fù)洚悩?gòu)酶組比較,水飛薊賓組的缺口或線性DNA(FormⅡ)均減少,超螺旋DNA(FormⅠ)均增多。(5)在1 MBIC和2 MBIC水飛薊賓作用下,6 h生物膜培養(yǎng)過夜后生物膜量較對照組分別少16.0%和25.0%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);24 h生物膜培養(yǎng)過夜后生物膜量較對照組分別少7.8%和9.0%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);48 h生物膜培養(yǎng)過夜后生物膜量較對照組分別少17.6%和25.9%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)不同階段表皮葡萄球菌生物膜在1 MBIC和2 MBIC水飛薊賓作用下培養(yǎng)過夜后,與對照組相比,結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同程度稀疏,死菌相比活菌分布更廣,死菌數(shù)量更多,生物膜厚度變薄。隨著用藥量的增加,這些變化更顯著。結(jié)論:1.水飛薊賓的抑菌活性(1)水飛薊賓對革蘭陽性菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株)的抑菌效果優(yōu)于革蘭陰性菌,其中對表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌效果最好(MIC=50μg/mL);水飛薊賓的抑菌活性明顯高于其同分異構(gòu)體。(2)在聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中,對于革蘭陽性菌,水飛薊賓與青霉素/紅霉素的聯(lián)合作用效應(yīng)以相加或無關(guān)為主,無協(xié)同作用或拮抗作用。對于革蘭陰性菌,水飛薊賓與環(huán)丙沙星的聯(lián)合作用效應(yīng)以拮抗為主,無協(xié)同作用或相加作用;水飛薊賓與慶大霉素的聯(lián)合作用效應(yīng)以無關(guān)作用為主,少數(shù)可產(chǎn)生拮抗作用,無協(xié)同作用或相加作用。2.水飛薊賓的抑菌機(jī)制水飛薊賓可通過抑制表皮葡萄球菌菌體蛋白和核酸的合成、拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性、生物膜形成等達(dá)到抑菌作用,但其對細(xì)菌細(xì)胞膜無影響。
【學(xué)位單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
中英文對照表
前言
第一部分 水飛薊賓抑菌活性的研究
    實(shí)驗(yàn)材料
    實(shí)驗(yàn)方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
第二部分 水飛薊賓的抑菌機(jī)制研究
    實(shí)驗(yàn)材料
    實(shí)驗(yàn)方法
    實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    討論
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
附錄1 水飛薊賓的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
附錄2 在讀期間公開發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、專著及科研成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2854657