自由基是人體正常生理代謝過程中產(chǎn)生的原子或基團(tuán),過量的自由基不僅會引發(fā)食品的鏈?zhǔn)窖趸?加速食品的腐敗變質(zhì),而且還會導(dǎo)致氧化應(yīng)激,引起肝臟疾病、糖尿病、神經(jīng)性退行疾病和心血管疾病等。目前常用的人工合成抗氧化劑,如:丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)和叔丁基對苯二酚(TBHQ),均具有毒副和致癌作用,因此,尋找天然、高效、低毒的抗氧化劑已經(jīng)成為了一種必然的趨勢。異藤黃酚作為一種異戊烯基取代的苯甲酮類天然化合物,具有抗炎、抗菌和抗瘧疾等多種生物活性。目前研究表明異藤黃酚在體外具有一定的抗氧化活性。因此,本研究采用體外化學(xué)測定法和細(xì)胞模型法分別檢測了異藤黃酚的抗氧化活性、細(xì)胞毒性、遺傳毒性以及異藤黃酚對H202誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用,并初步探究了保護(hù)機(jī)制。同時(shí)還利用化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和高效液相色譜分析法分別檢測了海南藤黃科三個(gè)屬7種代表性植物樹皮的抗氧化活性及其中異藤黃酚的含量,準(zhǔn)確地了解了其資源,為異藤黃酚的開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。其中詳細(xì)的結(jié)果如下:(1)在DPPH和ABTS實(shí)驗(yàn)中,異藤黃酚對兩者的清除能力均強(qiáng)于VC和BHT,并與濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系。其中,異藤黃酚的IC50分別是36.27 ±3.35和16.63 ±3.98 μM。在還原能力測定實(shí)驗(yàn)中,隨著異藤黃酚濃度的升高,反應(yīng)體系的吸光值不斷增大,但始終弱于VC和BHT。異藤黃酚抗脂質(zhì)過氧化能力與BHT相當(dāng)。而且,隨著異藤黃酚濃度的增大,FRAP值也越大。(2)在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,異藤黃酚的濃度在1～10 μM范圍內(nèi)時(shí),細(xì)胞的存活率均在95%以上。但當(dāng)濃度為13和15 μM時(shí),細(xì)胞的存活率分別下降到88.87%和82.28%。在遺傳毒性實(shí)驗(yàn)中,異藤黃酚在50和100 μM時(shí)細(xì)胞沒有顯示出明顯的拖尾現(xiàn)象,在500μ 時(shí)顯示出輕微的拖尾。而BHT在50μ 時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)明顯的拖尾,在500 μM時(shí),拖尾現(xiàn)象更加明顯。(3)通過CCK-8法確定了 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的最佳建模條件為H202濃度為500μ 時(shí),誘導(dǎo)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞3 h。此時(shí)細(xì)胞的存活率是對照組的56.13%,達(dá)到了顯著水平(p 0.01)。經(jīng)終濃度為0.5,1和1.5 μM的異藤黃酚預(yù)保護(hù)的細(xì)胞與僅用H202處理的細(xì)胞相比,其細(xì)胞存活率分別提高了 12.67%、25.01%和28.93%,并且差異顯著(p 0.01)。此外,相同處理濃度(1.5 μM)時(shí),異藤黃酚處理組(76.68%)的細(xì)胞存活率明顯高于BHT處理組(67.99%)但低于VE處理組(81.57%)。(4)在探究異藤黃酚保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷機(jī)制的過程中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HepG2細(xì)胞經(jīng)過異藤黃酚(0.5～1.5 μM)預(yù)先處理后,LDH的漏出率和ROS水平比H2O2處理組分別降低了 10.67%～36.61%和16.83%～40.91%,均達(dá)到了顯著差異水平,且呈現(xiàn)出劑量依賴型關(guān)系。此外,MDA含量分別比H202處理組降低了 10.41 ～42.27%。同時(shí),HepG2細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后,H2O2處理組中GSH的含量(5.71 nmol/mg protein)比正常對照組(16.41 nmol/mgprotein)降低了 65.20%。而經(jīng)異藤黃酚預(yù)保護(hù),細(xì)胞內(nèi)的GSH含量比H202處理組顯著地得到了提高(p0.05)。而且當(dāng)濃度為1.5 μM時(shí),異藤黃酚(21.96 nmol/mg protein)保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)的GSH含量分別比正常對照組提高了 33.82%。經(jīng)過0.5～1.5μ 異藤黃酚預(yù)先保護(hù)細(xì)胞,體內(nèi)的SOD活性與H202處理組相比,也分別提高了 25.18～51.11%。(5)海南藤黃科三個(gè)屬代表性植物的樹皮提取液隨著濃度的增加,其抗氧化活性體現(xiàn)出遞增的趨勢,其中紅厚殼屬植物紅厚殼對DPPH和ABTS自由基的清除效果最好,而薄葉紅厚殼和多花山竹子的活性最弱。在還原能力實(shí)驗(yàn)中,藤黃屬植物(嶺南山竹子,多花山竹子和山竹子)的還原能力高于紅厚殼屬(紅厚殼和薄葉紅厚殼)和黃牛木屬(黃牛木和越南黃牛木)的植物。樹皮提取液清除超氧自由基(O2-)的能力與濃度成正相關(guān)的關(guān)系。在清除率為50%的時(shí)候,山竹子、越南黃牛木和紅厚殼的抗氧化性明顯高于其余四種植物。(6)異藤黃酚在山竹子、嶺南山竹子、單花山竹子、黃牛木、薄葉紅厚殼中的含量分別為0.285%、0.199%、0.857%、0.161%和0.006%,而越南黃牛木和紅厚殼中沒有檢測出異藤黃酚。綜上所述,本研究揭示了異藤黃酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性,較低的細(xì)胞毒性和遺傳毒性,能夠?qū)202誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用。此作用的發(fā)揮主要依賴于異藤黃酚對細(xì)胞內(nèi)ROS含量、LDH漏出率和MDA水平的降低。同時(shí),異藤黃酚還可以增加細(xì)胞內(nèi)GSH含量和SOD活性,從而減少體內(nèi)自由基的含量。此外,海南藤黃科的具有一定的抗氧化活性,而且在三個(gè)屬7種代表性植物樹皮中,異藤黃酚在藤黃屬植物(山竹子、嶺南山竹子、單花山竹子)中含量較高,尤其單花山竹子含量最為豐富。因此,異藤黃酚具有較好的抗氧化效果,毒性較低,而且來源豐富,有望成為一種新型抗氧化劑,用于氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的治療。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

ＤＰＰＨ？是一種為數(shù)不多的穩(wěn)定型有機(jī)氮自由基，它能溶于乙醇溶液顯示出紫紅??色，在５１７?ｎｍ處有最大吸光值，通過與抗氧化劑結(jié)合，導(dǎo)致顏色變淺，吸光值減小，??抑制率降低，從而評估抗氧化劑清除自由基的活性（曾維才等，２０１３）。從圖２可知，??由圖可知，隨著異藤黃酚濃度的增加，對ＤＰＰＨ？的清除率也在逐步增大，但增幅逐??漸減少，說明異藤黃酚的濃度與清除ＤＰＰＨ？的能力不僅存在正量效關(guān)系，而且具有??飽和型特征。主要是由于ＤＰＰＨ？濃度一定時(shí)，異藤黃酚濃度己經(jīng)超出了反應(yīng)體系中??清除ＤＰＰＨ？所需要的濃度。ＩＣ５〇表示當(dāng)清除率為５０％時(shí)所需抗氧化物質(zhì)的濃度，因此，??ＩＣ５０值越小，其清除能力就越強(qiáng)，其抗氧化活性就越強(qiáng)。通過ＩＣ５〇計(jì)算軟件，得出異??藤黃酚、ＶＣ?和?ＢＨＴ?的?ＩＣ５０分別為?３６．２７?±３．３５、６６．０１?±１．９０?和?１１６．２６?±２．５５?ｎＭ?（如??表３）。異藤黃酚的抗氧化活性強(qiáng)于對照ＶＣ和ＢＨＴ，分別是它們的２倍和３倍，達(dá)??到了極顯著水平（ｐ＜?０．０１）。因此，在清除ＤＰＰＨ？實(shí)驗(yàn)中，異藤黃酚表現(xiàn)出很強(qiáng)的??抗氧化活性。??１００－１??９〇－?Ｉｓｏ??？?７０－?＋?Ｖｃ??Ｓ?Ｘ?ＢＨＴ??ｓｏ－?／?

陽離子自由基ＡＢＴＳ％?ＡＢＴＳ？在抗氧化物質(zhì)的作用下，能夠被部分或者完全清除，??溶液顏色變淺，然后通過檢測吸光值變化得出抑制率，從而確定該物質(zhì)的抗氧化能力。??吸光值越大，抑制率越大，則抗氧化性越好（ＩｌｈａｍｉＧ，２０１２）。由圖３可知，隨著??異藤黃酚濃度的增加，異藤黃酚對ＡＢＴＳ？的清除率也在不斷地增大，而且關(guān)系接近??線性，這說明異藤黃酚濃度與清除ＡＢＴＳ？的能力存在劑量依賴型關(guān)系。此外，在測??試范圍內(nèi)異藤黃酚的清除率始終大于ＶＣ和ＢＨＴ，且由表３可知，異藤黃酚、ＶＣ和??ＢＨＴ?的?ＩＣ５０?分別為?１６．６３?±?３．９８、５９．４３?±?３．４５?和?１８３．４?±?３．８９?ｐＭ，ＩＣ５０分別是它們的??１／３和１／１１。因此，在ＡＢＴＳ？清除實(shí)驗(yàn)中，異藤黃酚同樣表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，??且強(qiáng)于對照ＶＣ和ＢＨＴ，與清除ＤＰＰＨ？的效果基本相同。??８０￣｜??Ｉｓｏ??７〇－?－?Ｖｃ??１０?２０?３０?４０?５０?６０?７０?８０??樣品濃度ＣｐｍｏＶＬ）??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ?（ｐｔｍｏｌ／Ｌ）??圖３異藤黃酚對ＡＢＴＳ？的清除能力??Ｆｉｇ．?３?Ｔｈｅ?ＡＢＴＳ？?ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｉｓｏｇａｒｃｉｎｏｌ??注：Ｉｓｏ：異藤黃酚；Ｖｃ：維生素Ｃ；?ＢＨＴ：?２，６－二叔丁基冰甲基苯酚??３．１．３異藤黃酚的還原能力??在實(shí)驗(yàn)中

注：Ｉｓｏ：異藤黃釀；Ｖｃ：維生素Ｃ；?ＢＨＴ：?２，６－二叔丁基－４－甲基苯酚??３．１．４異藤黃酚抗脂質(zhì)過氧化的能力??從圖５中得知，異藤黃酚和ＢＨＴ的抗脂質(zhì)過氧化能力與濃度呈量效關(guān)系。隨著??濃度的增加，其抗脂質(zhì)過氧化能力也在不斷增強(qiáng)。但異藤黃酚和ＢＨＴ的抗脂質(zhì)過氧??化能力相當(dāng)。在測試濃度范圍內(nèi)，當(dāng)濃度大于１８０?ｐＭ時(shí)，異藤黃酚抗脂質(zhì)過氧化能??力略高于ＢＨＴ。經(jīng)計(jì)算，異藤黃酚和ＢＨＴ的ＩＣ５Ｇ分別為１７５．８３和１７８．０９?（ｉＭ，兩者??之間不存在顯著差異（ｐ＜?〇．〇５＿）。??＿?８０－??己?７０－?－？？－?Ｉｓｏ??Ｓ．Ｉ?６０－?＊?ＢＨＴ??Ｉ�。海海�??ｇ．ｆ３〇－??Ｓｆ?２〇－ｉｒ＾＊＾??ｇ?１０－＾＾??＾?〇Ｊ?．?．?．?．?．?．??２０?６０?１００?１４０?１８０?２２０?２６０??ｉｔ？?濃度（ｉ－ｉｎｉｏｌ／Ｌ）??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ?（ｐ．ｍｏｌ／Ｌ）??圖５異藤黃酚抗脂質(zhì)過氧化能力??Ｆｉｇ．?５?Ｔｈｅ?ａｎｔｉ－ｌｉｐｉｄ?ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｉｓｏｇａｒｃｉｎｏｌ??注：Ｉｓｏ：異藤黃釀；ＢＨＴ：?２，６－二叔丁基冬甲基苯酚??３．１．５總抗氧化能力的測定??ＦＲＡＰ法主要是基于還原反應(yīng)來測定某種物質(zhì)的總抗氧化能力。酸性條件下抗氧??化物可以還原Ｆｅ－ＴＰＴＺ產(chǎn)生藍(lán)紫色的Ｆｅ－ＴＰＴＺ，隨后在５９３?ｎｍ測定吸光度，即可作??為樣品中的總抗氧化能力的指標(biāo)。其中，總抗氧化能力用ＦｅＳ０４標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表??示。從圖６中可以得知
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2854082