人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性原發(fā)性腫瘤,是癌致死的主要原因之一。膠質(zhì)瘤患者手術(shù)和放療后均需要化療。但是,常規(guī)的化療對人腦膠質(zhì)瘤的治療效果并不理想,這可能是由于腫瘤細胞抗凋亡表型的存在。同時,膠質(zhì)瘤細胞所具有的高度侵襲和遷移的能力也使其可以頻繁地轉(zhuǎn)移到腫瘤周圍組織,促進腫瘤的復發(fā),由此很大程度上導致了膠質(zhì)瘤患者的不良預后。因此,開發(fā)能夠有效抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲和遷移的藥物,尤其是可以通過半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase)非依賴性途徑作用的藥物是非常必要的科研工作。自噬是將細胞質(zhì)中異常的細胞器和蛋白質(zhì)傳遞給溶酶體進行降解,以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過程。自噬對于不同的腫瘤細胞刺激物或者不同類型的腫瘤細胞而言,其生物效應也是不同的。雖然如此,許多研究已經(jīng)證實,一些天然產(chǎn)物或者癌癥治療藥物可以通過激活自噬途徑,誘導腫瘤細胞caspase非依賴性死亡,以及抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移�；钚匝醮�(ROS)堆積、蛋白激酶B(Akt)-雷帕霉素的哺乳動物靶標蛋白(mTOR)信號通路的抑制、c-JunNH2-末端激酶(JNK)信號通路的活化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應激以及核轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)蛋白的激活都與自噬-溶酶體途徑的調(diào)節(jié)相關(guān)。自噬除了可以誘導腫瘤細胞死亡外,還可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。同時,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)通過降解細胞外基質(zhì)(ECM),在腫瘤細胞侵襲的過程中發(fā)揮重要作用。腫瘤細胞所處的炎性微環(huán)境也是促進其侵襲和遷移的重要原因之一。青藤堿是傳統(tǒng)中藥青風藤[Sinomeniumacutum Rehd.et Wils.(Fam.Menispermaceae)]中主要的生物堿類活性成分,由于其抑制免疫和抗炎的作用,在臨床上被廣泛地應用于治療類風濕性疾病。鹽酸青藤堿(SH)是青藤堿的鹽酸鹽。最近,青藤堿的抗腫瘤作用越來越受到國內(nèi)外相關(guān)學者的關(guān)注,其分子機制與誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲和遷移、促進腫瘤血管正�；⒖鼓[瘤多藥耐藥以及協(xié)同用藥增強療效相關(guān)。此外,青藤堿在實驗研究中對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病,如焦慮癥、阿爾茨海默病、帕金森病、缺血再灌注腦損傷和實驗性自身免疫性腦脊髓炎,均具有良好的改善作用。本課題組前期研究成果,以SH為主要成分的新藥CQ復方,其對神經(jīng)源性疼痛和癌性疼痛均具有顯著的鎮(zhèn)痛效果。因此,本文旨在明確SH對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤-人腦膠質(zhì)瘤是否具有治療作用,是否可以抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲和遷移,并闡明其相關(guān)的作用機制。本研究從整體水平、組織和細胞水平、亞細胞和分子水平,系統(tǒng)地探討了是否SH能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖及其可能的干預途徑。結(jié)果顯示:(1)SH能夠劑量依賴性地降低人腦膠質(zhì)瘤細胞U87和SF767的細胞存活率,增加乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量,減少腫瘤細胞的集落形成,對正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞無顯著毒性。(2)SH能夠劑量依賴性地降低細胞周期蛋白(cyclin)Dl、cyclinD3、cyclin E和細胞周期蛋白依賴激酶(CDK)4的表達水平,提高p21和p27的表達水平,使U87和SF767細胞的G0/G1期分布增多。(3)SH作用于U87和SF767細胞,未見顯著的Annexin V-FITC染色單陽細胞的增多及caspase-3的剪切;caspase抑制劑對于SH介導的人腦膠質(zhì)瘤細胞存活率降低無影響。(4)SH增加了 U87和SF767細胞內(nèi)酸性囊泡、自噬溶酶體的數(shù)量,提高了微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)-II的表達水平;溶酶體抑制劑增強了 SH介導的LC3B-Ⅱ表達水平提高,自噬相關(guān)基因沉默抑制了 SH介導的LC3B-Ⅱ表達水平增強,同時,自噬抑制逆轉(zhuǎn)了 SH介導的U87和SF767細胞的細胞存活率下降,自噬激動促進了 SH介導的U87和SF767細胞的細胞存活率降低。(5)SH提高了 U87和SF767細胞內(nèi)ROS水平,抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)逆轉(zhuǎn)了 SH介導人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)ROS的堆積、LC3B-Ⅱ和自噬相關(guān)蛋白(ATG)5的表達提高,以及細胞存活率的下降。(6)SH降低了 U87和SF767細胞內(nèi)Akt-mTOR信號通路相關(guān)蛋白分子的表達水平,提高了 JNK通路相關(guān)信號分子的表達水平。同時,Akt特異性激動劑胰島素樣生長因子-1(IGF-1)預處理后,逆轉(zhuǎn)了 SH誘導的人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)Akt-mTOR信號通路相關(guān)蛋白分子的表達抑制以及LC3B-Ⅱ的表達水平提高。JNK特異性抑制劑SP600125預處理后,逆轉(zhuǎn)了 SH誘導的人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)JNK信號通路相關(guān)蛋白分子和LC3B-Ⅱ的表達水平提高。(7)NAC預處理后,逆轉(zhuǎn)了 SH介導的人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)Akt-mTOR途徑相關(guān)信號分子的表達水平降低以及JNK途徑相關(guān)信號分子的表達水平提高;IGF-1以及SP600125預處理后,對SH介導的人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)ROS的堆積無影響。(8)SH能夠增加U87和SF767細胞內(nèi)溶酶體的數(shù)量,提高溶酶體標志蛋白的表達水平,降低細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)蛋白的表達水平,提高細胞核內(nèi)TFEB蛋白的表達水平。(9)SH劑量依賴性地降低了 U87細胞異種移植瘤的瘤體積、瘤重,且對裸鼠體重無顯著影響,并在體內(nèi)實驗中干預了與體外實驗研究中相一致的信號分子。本研究從整體水平、組織和細胞水平、亞細胞和分子水平、基因水平,系統(tǒng)地探討了是否SH能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲、遷移及其可能的干預途徑。結(jié)果顯示:(1)SH劑量依賴性地抑制了 U87和SF767細胞侵襲、遷移。(2)SH劑量依賴性地降低了 U87和SF767細胞內(nèi)MMP-2/-9 mRNA和MMP-2/-9蛋白的表達水平。同時,SH提高了 U87和SF767細胞內(nèi)核因子kappa B(NFκB)p65和NFκB抑制蛋白(IκB)-α的結(jié)合能力,降低了 P-IκB激酶(IKK)p、P-IκB-α、NFκB p65的表達水平。NFκB p65過表達逆轉(zhuǎn)了 SH介導的人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)MMP-2/-9的表達水平以及細胞侵襲能力的降低。(3)SH增加了人腦膠質(zhì)瘤細胞 二內(nèi)Ca2+的濃度以及ER應激相關(guān)蛋白分子的表達水平。SH提高了 U87和SF767細胞內(nèi)自噬溶酶體的數(shù)量和LC3B-Ⅱ的表達水平,同時,降低了間質(zhì)樣標志蛋白vimentin、Slug和Snail的表達水平。CCAAT/增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)同源蛋白(CHOP)或者ATG5沉默逆轉(zhuǎn)了 SH介導人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)LC3B-ⅡⅡ的表達水平提高以及間質(zhì)樣標志蛋白分子的表達水平降低。4-苯丁酸(4-PBA)或者3-甲基腺嘌呤(3-MA)預處理后,逆轉(zhuǎn)了 SH介導人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)自噬溶酶體數(shù)量的增加以及細胞侵襲能力的降低。(4)SH逆轉(zhuǎn)了體外實驗中模擬炎性微環(huán)境所誘導的U87和SF767細胞內(nèi)間質(zhì)樣標志蛋白vimentin、Slug、Snail的表達水平以及細胞侵襲能力的提高。(5)SH在體內(nèi)實驗中干預了與體外實驗研究中相一致的信號分子。結(jié)論Ⅰ:本研究首次提出SH在體內(nèi)和體外實驗中能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用,并闡明了 SH可以誘導腫瘤細胞自噬性死亡的新機制。主要的研究結(jié)論如下:(1)SH能夠誘導人腦膠質(zhì)瘤細胞G0/G1期阻滯;(2)SH能夠選擇性地誘導人腦膠質(zhì)瘤細胞自噬性死亡,而非凋亡;(3)SH能夠通過促進ROS堆積,抑制Akt-mTOR信號通路以及激活JNK信號通路,誘導人腦膠質(zhì)瘤細胞自噬;(4)SH可能通過誘導TFEB核易位,促進人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)溶酶體的生物合成;(5)SH能夠抑制U87細胞異種移植瘤的生長,且在給藥期間對裸鼠本身未見顯著毒副作用。Ⅱ:本研究首次提出SH能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲和遷移,其相關(guān)分子機制主要為:(1)通過鈍化NFκB,抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)MMP-2/-9的表達;(2)通過誘導ER應激介導的自噬,逆轉(zhuǎn)人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)源性的EMT;(3)通過逆轉(zhuǎn)腫瘤炎性微環(huán)境誘導的人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)外源性的EMT,降低腫瘤細胞的侵襲能力。綜上所述,本研究提示青藤堿有潛力作為一種新的抗人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖,侵襲和遷移的候選藥物,并為進一步開發(fā)青藤堿成為治療人腦膠質(zhì)瘤的臨床用藥提供了理論依據(jù),同時,為有效治療人腦膠質(zhì)瘤的藥物開發(fā)提供了新的參考。
【學位單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

為了進一步闡明ＲＯＳ對ＳＨ介導的人腦膠質(zhì)瘤細胞死亡的影響，我??們進行了?ＣＣＫ－８實驗。結(jié)果表明，經(jīng)ＮＡＣ預處理后，可以顯著逆轉(zhuǎn)ＳＨ介導的??Ｕ８７和ＳＦ７６７細胞的細胞存活率下降（圖３Ｅ）。??綜上所述，這些結(jié)果提示，ＳＨ能夠顯著提高Ｕ８７和ＳＦ７６７細胞中ＲＯＳ的??７ＪＣ平，并且ＲＯＳ是ＳＨ介導的人腦膠質(zhì)瘤細胞自噬性死亡的上游信號分子。??６８??

圖４后續(xù)??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｃｏｎｔ．??

?此外，我們還研宄了?ＪＮＫ信號通路是否也參與了?ＳＨ介導的人腦膠質(zhì)瘤細??胞自噬。如圖４Ａ所示，ＳＨ劑量依賴性地上調(diào)了?Ｕ８７和ＳＦ７６７細胞內(nèi)Ｂｅｃｌｉｎ－１、??Ｐ－Ｂｃｌ－２和Ｐ－ＪＮＫ１的表達水平。ＪＮＫ抑制劑ＳＰ６００１２５預處理后，顯著減弱了?ＳＨ??介導的兩種人腦膠質(zhì)瘤細胞系中Ｂｅｃｌｉｎ－１、ＬＣ３Ｂ－ＩＩ和Ｐ－ＪＮＫ１表達水平的提高??（圖４Ｃ）。這些結(jié)果提示，ＳＨ誘導的人腦膠質(zhì)瘤細胞自噬需要ＪＮＫ信號通路的??活化。??綜上所述，ＳＨ能夠誘導人腦膠質(zhì)瘤細胞自噬，歸因于ＪＮＫ信號通路的活化??以及Ａｋｔ－ｍＴＯＲ信號通路的抑制。??Ａ?Ｕ８７?ＳＦ７６７??Ｐ－Ａ？?一讀??Ａｋｔ?Ａｋｔ?麵＿?ｍｍｍ?ｒｎｔｓｍ?ｍＭｆｅ??決一把??？?Ｐ－ｍＴＯＲ?”丨…＂＿＿＿?ｖｍｒｎｍｍｍ?＿＿＿＿??Ｐ－ｍＴＯＲ?ｙｉ：?．一?：，一?－一…。??ｍＴ〇Ｒ?？ｒ－ｒｆ?ｒ—－?－—－？?－?ｍＴ０Ｒ?ｒ；ｆｗ？Ｓ＃ｅｒ?．?ｗｍ＾ｍ??？懸＿?？麵麵―Ｈｉ＃?，一麵??Ｐ－４Ｅ－ＢＰ１?４＞ｍ?＾?ｍｍ?－？？?Ｐ＾Ｅ－ＢＰ１?ｍｍｍ??＝?＿＿＿?＝?：＝、：；露畫薦??ｊｎｋ２?樣零擎＿?修，？?ｊｎｋ２?ＷＫｔＨＨｔ＇?ＩＷｉｊｌｉｆ?＿ＨＷ?賴＿９｜１１??ＪＮＫ１?一—?？通貫一，＿…剛—ｗｗ?ｊｎｋｉ
【參考文獻】

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本文編號：2852950