為探索樺褐孔菌(Inonotus obliquus)三萜是否能作為α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶天然抑制劑,采用硅膠柱色譜洗脫樺褐孔菌提取物,通過薄層色譜檢測進(jìn)行分離、純化,結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用色譜和核磁共振波譜對樺褐孔菌中的生物活性物質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:從樺褐孔菌發(fā)酵菌絲體中發(fā)現(xiàn)了樺褐孔菌萜D、lawsaritol和白樺脂酸,并從子實(shí)體中得到羊毛甾醇、樺褐孔菌醇和栓菌酸;樺褐孔菌子實(shí)體中的樺褐孔菌醇對α-葡萄糖苷酶具有最強(qiáng)抑制活性,液體深層發(fā)酵產(chǎn)物樺褐孔菌萜D對α-淀粉酶具有最強(qiáng)抑制活性,其IC_(50)值均低于陽性對照的阿卡波糖;酶抑制動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明,樺褐孔菌醇對α-葡萄糖糖苷酶作用機(jī)制為競爭性抑制,樺褐孔菌萜D對α-淀粉酶的抑制類型為非競爭性與競爭性抑制混合。
【部分圖文】：

微生物發(fā)酵一般呈S型生長,依次經(jīng)歷適應(yīng)期、對數(shù)生長期、平衡期和衰亡期4個(gè)階段[27]。樺褐孔菌的液體發(fā)酵生長曲線如圖1所示。由圖1可知,樺褐孔菌在發(fā)酵初期處于適應(yīng)期,菌絲體由種子培養(yǎng)基接種到發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中需要適應(yīng)新的營養(yǎng)環(huán)境,但由于種子培養(yǎng)基和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成成分相近,因此之后很快進(jìn)入對數(shù)生長期;在2～5 d,菌絲體適應(yīng)新環(huán)境后,開始大量快速繁殖,呈現(xiàn)出對數(shù)生長狀態(tài);發(fā)酵5 d以后菌絲體生長速度下降,達(dá)到平衡期;隨著發(fā)酵液中還原糖的消耗、代謝產(chǎn)物積累,菌絲體量與第9 d開始出現(xiàn)下降趨勢,進(jìn)入衰亡期;在前8 d的液體深層發(fā)酵中,發(fā)酵液的pH值隨著發(fā)酵的進(jìn)行而急劇下降之后有所回升,其原因可能是發(fā)酵后期代謝產(chǎn)物積累及菌體衰亡導(dǎo)致;發(fā)酵9 d以后發(fā)酵液中葡萄糖濃度下降到3.6 mg/mL,菌體基本停止生長;發(fā)酵9 d對樺褐孔菌生物量積累是最佳周期,生物量為9.3 g/L;三萜化合物屬于樺褐孔菌的次級代謝產(chǎn)物,從第1～9 d,樺褐孔菌菌絲體總?cè)飘a(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而上升,且在第3～5 d快速積累,第6 d開始菌絲體總?cè)飘a(chǎn)量增加緩慢,到達(dá)第9 d三萜產(chǎn)量達(dá)到最大,為628.4 mg/L。2.2 菌絲體分段物抑酶活性

表1 分段物的得率、三萜含量及對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性抑制 分段物 得率/% 三萜含量/% α-葡萄糖苷酶IC50/(mg·mL-1) α-淀粉酶IC50 /(mg·mL-1) 分段物1 28.87 31.6 34.12±2.63g >100 分段物2 19.50 39.9 >100 >100 分段物3 4.08 34.1 >100 >100 分段物4 9.40 78.8 1.33±0.02c 7.86±1.55a 分段物5 3.88 82.1 9.61±0.06f >100 分段物6 1.94 73.9 36.49±3.68g >100 分段物7 2.29 62.2 1.52±0.03d 15.59±2.64b 分段物8 4.02 76.5 0.26±0.02a 8.88±0.86a 分段物9 8.75 50.5 3.32±0.03e >100 分段物10 8.00 70.2 >100 >100 阿卡波糖 — — 0.37±0.01b 10.51±0.72a 注:同列不同小寫字母表示α-葡萄糖苷酶抑制活性存在顯著差異,p<0.05。2.3 子實(shí)體三萜單體抑酶活性

在樺褐孔菌菌絲體提取分段物和子實(shí)體提取單體中,化合物2對α-葡萄糖苷酶具有最強(qiáng)抑制效果,分段物4對α-淀粉酶的抑制效果最好。在不同濃度化合物2作用下酶動(dòng)力學(xué)圖如圖4(a)所示。由圖4(a)可知,隨著化合物2的質(zhì)量濃度的增大,雙倒數(shù)直線與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)變大,與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)不變,表明米氏常數(shù)Km增大,反應(yīng)最大速率Vmax不變。表明化合物2對α-葡萄糖苷酶的抑制方式屬于競爭性抑制。圖4(b)表明,采用雙倒數(shù)法確定分段物4對α-淀粉酶的抑制方式屬于非競爭性與競爭性混合型抑制,與目前市售α-葡萄糖糖苷酶/α-淀粉酶主要抑制劑阿卡波糖類似,對α-葡萄糖糖苷酶作用機(jī)制為競爭性抑制,對胰α-淀粉酶的抑制類型為非競爭性與競爭性抑制混合類型[28-29]。表2 子實(shí)體中3個(gè)化合物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性抑制 化合物 α-葡萄糖苷酶IC50/(mg·mL-1) α-淀粉酶IC50 /(mg·mL-1) 化合物1 0.60±0.01d 9.51±0.74a 化合物2 0.15±0.02a 14.31±0.71b 化合物3 0.43±0.09c >100 阿卡波糖 0.37±0.01b 10.51±0.72a 注:同列不同小寫字母表示α-淀粉酶抑制活性存在顯著差異,p<0.05。
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