目的本研究旨在探討藍(lán)萼甲素在人膀胱癌細(xì)胞的抗腫瘤作用及具體機(jī)制,從而為開(kāi)發(fā)靶向PI3K/Akt通路治療膀胱癌的藥物提供新思路。方法1.研究藍(lán)萼甲素對(duì)人膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制作用1.1通過(guò)CCK-8法檢測(cè)藍(lán)萼甲素對(duì)人膀胱癌細(xì)胞體外增殖的影響;1.2平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藍(lán)萼甲素對(duì)UMUC3細(xì)胞集落形成能力的影響;2.藍(lán)萼甲素對(duì)膀胱癌細(xì)胞UMUC3抗腫瘤作用的機(jī)制探討2.1用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)經(jīng)藍(lán)萼甲素處理后UMUC3細(xì)胞周期的變化;2.2用AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)UMUC3細(xì)胞凋亡的發(fā)生;2.3 Western Blot方法分析周期、凋亡及PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的變化,從而驗(yàn)證藍(lán)萼甲素是否通過(guò)PI3K/Akt通路誘導(dǎo)UMUC3細(xì)胞凋亡和G2/M周期阻滯;2.4用細(xì)胞免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)藍(lán)萼甲素作用于UMUC3細(xì)胞后PI3K/Akt通路中p-Akt和Cleaved Caspase-3的細(xì)胞定位及表達(dá)量變化;3.藍(lán)萼甲素對(duì)小鼠模型UMUC3移植瘤的影響及機(jī)制研究3.1皮下成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在體內(nèi)水平下UMUC3細(xì)胞的成瘤能力以及藍(lán)萼甲素對(duì)NOD/SCID小鼠模型UMUC3腫瘤的影響;3.2用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藍(lán)萼甲素對(duì)皮下瘤組織中細(xì)胞增殖活性指標(biāo)Ki-67和微血管密度指標(biāo)CD31的影響。結(jié)果1.藍(lán)萼甲素抑制人膀胱癌細(xì)胞的增殖和克隆形成1.1 10μM藍(lán)萼甲素對(duì)人膀胱癌細(xì)胞UMUC3、HT1197、T24和J82的增殖有明顯的抑制作用,但對(duì)人膀胱永生化細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯抑制作用。不同濃度藍(lán)萼甲素(0、2.5、5、10或40 μM)呈時(shí)間和劑量依賴性的抑制UMUC3細(xì)胞的活力,處理24、48、72和96小時(shí)后IC50值分別為18.87、9.77、6.75、5.40 μM。1.2與對(duì)照組相比,藍(lán)萼甲素對(duì)UMUC3細(xì)胞集落形成的數(shù)量和大小呈現(xiàn)濃度依賴的明顯抑制作用。2.藍(lán)萼甲素可以使UMUC3細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在G2/M期2.1細(xì)胞流式結(jié)果分析,隨著藍(lán)萼甲素濃度的升高,更多的細(xì)胞停滯在G2/M期,更少的細(xì)胞停滯在G0/G1期,而S期變化則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這表明藍(lán)萼甲素可引起UMUC3細(xì)胞阻滯在G2/M期。2.2免疫印跡法提示藍(lán)萼甲素可引起p21WAF1/CIP1蛋白表達(dá)水平上調(diào),但同時(shí)下調(diào)了 CyclinB1、CDK1和Cdc25C蛋白表達(dá)水平。3.藍(lán)萼甲素誘導(dǎo)UMUC3細(xì)胞線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡3.1不同濃度藍(lán)萼甲素處理UMUC3細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞凋亡率分別為(10.16 ±1.10)%、(29.99 ±8.55)%和(53.61 ±5.11)%,但對(duì)照組的的細(xì)胞凋亡率僅為(4.37±1.17)%。3.2免疫印跡法分析表明,與對(duì)照組相比,藍(lán)萼甲素實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)水平增加,但Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值隨著藍(lán)萼甲素濃度升高而上調(diào)。此外,藍(lán)萼甲素作用于UMUC3細(xì)胞后Caspase-9、Caspase-3、PARP蛋白表達(dá)水平下降,與之相應(yīng)的是有明顯的Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP 蛋白的累積變化。3.3免疫熒光染色顯示,藍(lán)萼甲素處理后胞漿和胞核Cleaved Caspase-3的表達(dá)量均明顯增加。4.藍(lán)萼甲素抑制UMUC3細(xì)胞的PI3K/Akt信號(hào)通路4.1藍(lán)萼甲素顯著降低PI3K p85的表達(dá)水平和減少了 AktSer473位點(diǎn)的磷酸化水平。但PTEN水平則隨著藍(lán)萼甲素藥物濃度升高而上調(diào),而總Akt的表達(dá)量無(wú)顯著性差異。4.2細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了 p-Akt(Ser473)蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的表達(dá)均有降低趨勢(shì)。5.通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明藍(lán)萼甲素對(duì)UMUC3細(xì)胞的抗腫瘤作用5.1為了評(píng)價(jià)藍(lán)萼甲素在體內(nèi)的抗腫瘤作用,我們成功建立了 UMUC3皮下移植瘤的NOD/SCID小鼠模型。5.2用藍(lán)萼甲素(20 mg/kg)處理的小鼠皮下移植瘤體積明顯小于對(duì)照組的腫瘤體積。對(duì)照組的腫瘤平均重量為(3.73 ±0.68)g,而藍(lán)萼甲素組的腫瘤平均重量為(1.71 ± 0.42)g。5.3在組織學(xué)水平上,我們分別選擇了 Ki-67和CD31這兩個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)藍(lán)萼甲素對(duì)細(xì)胞增殖和微血管密度的影響。藍(lán)萼甲素均可明顯抑制移植瘤組織中Ki-67和CD31的表達(dá)水平。結(jié)論1.藍(lán)萼甲素抑制人膀胱癌細(xì)胞的增殖,呈時(shí)間和劑量依賴性。2.藍(lán)萼甲素通過(guò)Cdc25C/Cyclin B1/CDK1通路引起UMUC3細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。3.藍(lán)萼甲素通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)UMUC3細(xì)胞凋亡。4.藍(lán)萼甲素通過(guò)抑制UMUC3細(xì)胞的PI3K/Akt通路誘導(dǎo)G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡。5.藍(lán)萼甲素有可能成為一種通過(guò)靶向PI3K/Akt通路治療膀胱癌的藥物。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

２．２藍(lán)萼甲素抑制ＵＭＵＣ３細(xì)胞的增殖及計(jì)算半數(shù)抑制濃度（ＩＣ５０）??用不同濃度藍(lán)萼甲素（０、２．５、５、１０或４０?ｐＭ）處理ＵＭＵＣ３細(xì)胞后，藍(lán)??萼甲素呈時(shí)間和劑量依賴性的抑制ＵＭＵＣ３細(xì)胞的活力（圖１－２）。藍(lán)萼甲素作??用?ＵＭＵＣ３?細(xì)胞?２４、４８、７２?和?９６?小時(shí)后?ＩＣ５０?值分別為?１８．８７、９．７７、６．７５?和?５．４０??｜ｉＭ〇??９??

我們利用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了藍(lán)萼甲素對(duì)ＵＭＵＣ３細(xì)胞的抑制??增殖作用。與對(duì)照組相比，藍(lán)萼甲素對(duì)ＵＭＵＣ３細(xì)胞集落形成的數(shù)量和大小均呈??現(xiàn)濃度依賴的明顯抑制作用（圖１－３）。??１０??

我們用免疫印跡法測(cè)定Ｇ２／Ｍ期相關(guān)的周期蛋白。結(jié)果表明藍(lán)萼甲素可引??起ｐ２１ＷＡＦ１／ＯＰ１蛋白表達(dá)水平上調(diào)，但同時(shí)下調(diào)了?Ｃｙｃｌｉｎ?Ｂｌ、ＣＤＫ１和Ｃｄｃ２５Ｃ??蛋白表達(dá)水平（圖２－２）。以上這些結(jié)果表明藍(lán)萼甲素通過(guò)劑量依賴的方式引起??ＵＭＵＣ３細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在Ｇ２／Ｍ期。??Ａ?ＧＬＡ（ｎＭ）?０?２０?４０?Ｂ??１－?￣￣？二―．二￣￣??２．５ｈ?＊??Ｐ２１?ｍｍ?ｍｍ?２?ｉ?＾Ｃｏｎｔｒｏｌ?????２．（Ｔ?｜?ＥＳ３?２０ｊｉＭ??ＣＤＫ１?ｍｍｍｍｒｎ?ｍ?．２?Ｂ?４０＾Ｍ??，?ｉ?＞?５＇?ｇ｜?＊ｐ＜〇．〇ｓ??ＣｙｅＵｎｍ?Ｍｌ?ｉＭｂ?ｔ?＾?Ａ％?＾????ｉ?ｉ＾ｉ?ＩＬ?ｉ＊??Ｐ＿ａｃｔｍ?°?ｐ２１?ＣＤＫ１?Ｃｙｃｌｉｎ?Ｂ１?Ｃｄｃ２５Ｃ??圖２－２免疫印跡法分析ＵＭＵＣ３細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?（Ａ
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2852638