目的:1.篩選去卵巢大鼠股骨遠端骨組織中差異表達的mRNA和lncRNA并進行功能性分析和生物信息學分析,探討其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中潛在作用;2.研究差異表達的mRNA富集的通路在去卵巢大鼠中的變化及骨疏康的調(diào)控作用;3.研究差異表達的lncRNA的靶基因及相關通路在去卵巢大鼠中的變化及骨疏康的調(diào)控作用。方法:1.去卵巢大鼠股骨mRNA和lncRNA表達譜研究24只6月齡SD大鼠隨機分為假手術組(sham,12只)和模型組(OVX,12只)。通過去卵巢法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型,以假手術大鼠作為對照,取兩組大鼠的股骨遠端骨組織進行高通量測序,建立股骨遠端骨組織中mRNA和lncRNA的表達譜并進行差異性分析,然后采用Real-time PCR對差異表達的結果進行擴大樣本量驗證,驗證測序結果的可靠性,最后對差異表達的mRNA和lncRNA進行功能性分析和生物信息學分析,以探討這些差異表達的mRNA和lncRNA在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中潛在作用。2.骨疏康抑制去卵巢大鼠骨細胞凋亡,激活BMP-2/Smads信號通路(1)骨疏康對去卵巢大鼠的骨保護作用48只6月齡SD大鼠隨機分為4組,每組12只:假手術組(sham組),模型組(OVX組),骨疏康組(GSK組),阿侖膦酸鈉組(ALN組)。建立去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型,12周后進行藥物干預,給藥劑量按照人與大鼠體表面積折算,GSK組給藥劑量為0.27g/kg,ALN組給藥劑量為1.02mg/kg,sham組和OVX組分別給予等體積生理鹽水灌胃。藥物干預12周后取材,進行各項指標的檢測:①麻醉后檢測大鼠全身骨密度和腰椎骨密度,②檢測離體股骨骨密度,③股骨遠端microCT掃描,④股骨遠端HE染色。(2)骨疏康對去卵巢大鼠BMP2/Smads信號通路的影響取上述實驗中大鼠,麻醉生效后,大鼠取仰臥位,大腿內(nèi)側入路去除肌肉組織,迅速分離雙側股骨,①左側股骨采用10%中性多聚甲醛固定24小時,進行ALP染色、Trap染色,②右側股骨采用液氮凍存,提取總RNA進行qRT-PCR檢測相關基因的表達,提取總蛋白和磷酸化的蛋白,采用western blot檢測相關蛋白的表達。(3)去卵巢大鼠骨組織中骨細胞凋亡情況及骨疏康的干預作用取上述實驗中大鼠左側股骨,進行TUNEL染色;取右側股骨提取總RNA進行qRT-PCR檢測相關基因的表達,提取總蛋白進行western blot檢測相關蛋白的表達。結果:1.去卵巢大鼠股骨mRNA和lncRNA表達譜研究(1)去卵巢大鼠動物模型的建立兩組大鼠造模12周后進行骨密度檢測,與sham組相比,OVX組大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。對離體股骨的骨密度檢測和microCT掃描發(fā)現(xiàn),與sham組相比,OVX組離體股骨的整體骨密度和股骨頭、股骨近端、股骨干、股骨遠端骨密度水平均顯著降低(P0.05)。對于microCT檢測結果,與sham組相比,OVX組中BV/TV,BS/TV和Tb.N的水平顯著降低,而Tb.Sp水平明顯增加(P0.05),兩組間Tb.Th比較雖然無統(tǒng)計學差異,但OVX組Tb.Th水平有下降趨勢。HE染色結果顯示,與sham組相比,OVX組骨小梁變薄,骨小梁數(shù)量明顯減少,排列稀疏,骨小梁間隙相對較寬,這與microCT的三維圖像相一致。這些結果表明,與sham組相比,OVX大鼠股骨的骨量明顯減少,股骨遠端的骨微結構明顯變差。(2)轉錄本的差異表達分析對兩組骨組織樣本進行高通量測序和轉錄本的差異表達分析,發(fā)現(xiàn)440條mRNA存在組間差異表達,其中160條上調(diào)和280條下調(diào),17條lncRNA存在組間差異表達,其中9條上調(diào)和8條下調(diào),21條TUCP存在組間差異,其中11條上調(diào)和10條下調(diào)。對差異表達的mRNA進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)所富集到的信號通路主要包括破骨細胞分化,抗原處理和呈現(xiàn),Hippo信號通路,雌激素信號通路,吞噬,RNA轉運,核糖體,泛素介導的蛋白水解,mTOR信號通路等,對lncRNA和TUCP進行靶基因預測,發(fā)現(xiàn)多個差異表達的轉錄本預測到BMP家族,對所有靶基因進行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),lncRNA和TUCP對核糖體途徑,胞吞作用,粘蛋白型O-聚糖生物合成,長期抑郁,FcγR介導的吞噬作用,甲狀腺激素信號通路,血管平滑肌收縮,神經(jīng)活性配體-受體相互作用,細胞溶質(zhì)DNA傳感途徑,RIG-I樣受體信號通路,TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等信號通路均有調(diào)節(jié)作用。2.骨疏康抑制去卵巢大鼠骨細胞凋亡,激活BMP-2/Smads信號通路實驗過程中,因各種意外死亡6只大鼠,最終納入研究的實驗動物數(shù)量為42只。(1)骨疏康對去卵巢大鼠的骨保護作用①對各組大鼠進行骨密度測定,發(fā)現(xiàn)與sham組相比,OVX組大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明顯減低(P0.05);與OVX組相比,GSK組和ALN組大鼠全身骨密度和腰椎骨密度均明顯升高(P0.05)。②對離體股骨的骨密度檢測發(fā)現(xiàn),OVX組股骨頭,股骨近端,股骨干,股骨遠端和股骨整體的骨密度水平均顯著低于sham組(P0.05)。在GSK組和ALN組中,股骨頭股骨,股骨近端,股骨干,股骨遠端和股骨整體的骨密度水平均顯著高于OVX組(P0.05)。其中,GSK組股骨遠端的骨密度水平高于ALN組,盡管沒有統(tǒng)計學差異。③對股骨遠端進行microCT掃描,發(fā)現(xiàn)與sham組相比,OVX組BV/TV,BS/TV,Tb.Th和Tb.N的水平顯著降低,而Tb.Sp水平增加(P0.05)。GSK和ALN組中Tb.Sp水平顯著降低,而其他參數(shù)水平則增加(P0.05)。而且,GSK和ALN組之間沒有統(tǒng)計學差異。這些數(shù)據(jù)表明GSK和ALN都能夠增加骨小梁體積。④對股骨遠端進行HE染色,發(fā)現(xiàn)OVX組骨小梁變薄,斷裂,骨小梁數(shù)量減少,骨小梁間隙增寬,而GSK組和ALN組骨小梁相對較厚實,連接較多,骨小梁間隙變窄。對比microCT的三維重建圖發(fā)現(xiàn),股骨骨小梁結構的變化與HE染色顯示的組織學變化一致。(2)骨疏康對去卵巢大鼠BMP2/Smads信號通路的影響①ALP染色和Trap染色發(fā)現(xiàn),OVX組骨小梁上ALP陽性成骨細胞數(shù)量減少,染色較淺,呈灰色甚至灰白色,TRAP陽性破骨細胞數(shù)量增加,酒紅色染色明顯甚至融合成片,主要位于骨小梁邊緣。與OVX組相比,GSK組ALP陽性成骨細胞染色變深,破骨細胞數(shù)量變少,染色呈淺紅色。②進行qRT-PCR檢測分析發(fā)現(xiàn),與sham組相比,OVX組中BMP-2,Osterix和Runx2的mRNA表達顯著下調(diào)(P0.05)。而Smadl和Smad5基因沒有明顯變化。有趣的是,GSK治療可引起B(yǎng)MP-2,Osterix和Runx2 mRNA水平的明顯上調(diào),而ALN組只有Runx2mRNA 水平上調(diào)(P0.05)。③進行western blot檢測分析發(fā)現(xiàn),與sham組相比,OVX組的BMP-2,Smadl,p-Smadl,p-Smad5和Runx2的蛋白質(zhì)表達水平下調(diào)(P0.05),Smad5和Osterix有下降趨勢,但無統(tǒng)計學差異,這說明在去卵巢大鼠模型中,BMP-2/Smads信號通路受到抑制。與 0VX 組相比,GSK 組 BMP-2,p-Smadl,p-Smad5,Osterix 和 Runx2 的蛋白表達水平均升高(P0.05)。ALN組BMP-2,p-Smadl,Osterix和Runx2的表達水平升高(P0.05)。(3)去卵巢大鼠骨組織中骨細胞凋亡情況及骨疏康的干預作用①TUNEL染色和凋亡率的測定提示,OVX組具有更多的TUNEL陽性骨細胞,與OVX組相比,GSK組TUNEL陽性骨細胞顯著減少(P0.05)②通過qRT-PCR檢測基因表達水平發(fā)現(xiàn),與sham組相比,OVX組Bcl-xL基因的表達水平降低(P0.05),Bak水平升高(P0.05),Bcl-2表達水平有所降低,但缺乏統(tǒng)計學意義。與OVX組相比,GSK組Bcl-xL的基因水平顯著增加,Bak水平顯著降低(PO.05)。③通過Western blot檢測蛋白水平發(fā)現(xiàn),與sham組相比,0VX組各蛋白水平與基因水平的檢測結果相符合。與OVX組相比,GSK組Bcl-xL蛋白水平升高,Bak蛋白水平降低(P0.05)。結論:1.去卵巢大鼠骨組織中存在440條差異表達的mRNA(160條上調(diào)和280條下調(diào)),其主要富集的通路與凋亡密切相關。2.去卵巢大鼠骨組織中存在差異表達的17條lncRNA(9條上調(diào)和8條下調(diào))和21條TUCP(11條上調(diào)和10條下調(diào)),對差異表達的lncRNA和TUCP的進行靶基因預測發(fā)現(xiàn)多個差異表達的轉錄本預測到BMP家族。3.骨疏康可通過刺激BMP-2/Smads信號途徑的活化,降低骨細胞的凋亡率來改善去卵巢大鼠股骨的骨密度和骨微結構特性。
【學位單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

采用ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ?ｖｌ．?３．?１進行新轉錄本的預測。ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ應用網(wǎng)絡流算法以及可??選的從頭組裝來組裝和定量代表每個基因座的多個剪接變體的全長轉錄物。設置不同??的篩選條件，篩選最終得到的ｌｎｃＲＮＡ進行后續(xù)分析，篩選流程如圖１所示：??＾???０４——ＫＢ??圖１篩選流程圖??在進行篩選之前，首先使用Ｃｕｆｆ＇ｍｅｒｇｅ軟件對各樣品拼接得到的轉錄本進行合并，并??去掉其中鏈方向不確定的轉錄本，得到本次測序完整的轉錄組信息。之后，對合并的??轉錄本集合按照圖１進行ｌｎｃＲＮＡ的篩選，其中對于ｓｔｅｐ５，取沒有編碼潛能的轉錄本??的交集作為本次分析預測得到的ＩｎｃＲＮＡ數(shù)據(jù)集，取至少被一種編碼潛能預測軟件認??為有編碼潛能的轉錄本作為本次分析的ＴＵＣＰ?（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ?ｏｆ?ｕｎｃｅｒｔａｉｎ?ｃｏｄｉｎｇ??ｐｏｔｅｎｔｉａｌ），這些轉錄本中可能包含一部分具有一定編碼潛能的ＩｎｃＲＮＡ，因此我們將??它們作為單獨的一類轉錄本納入到后續(xù)的分析［｜７１］。本次分析采用ＣＮＣＩ??（Ｃｏｄｉｎｇ－Ｎｏｎ－Ｃｏｄｉｎｇ－Ｉｎｄｅｘ）?（ｖ２）分析工具［１＜」、ＣＰＣ?（Ｃｏｄｉｎｇ?Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ?Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）??（０．９－ｒ２）分析工具［１７３］和?Ｐｆａｍ?Ｓｃａｎ?（ｖｌ．?３）?Ｕ７４’１７Ｓ］分析工具。??（４）

統(tǒng)計學差異，但０ＶＸ組Ｔｂ．Ｓｐ水平有增高趨勢、Ｔｂ．Ｔｈ水平有下降趨勢（表１０）。ＨＥ??染色結果顯示，與ｓｈａｍ組相比，０ＶＸ組骨小梁變薄，骨小梁數(shù)量明顯減少，排列稀疏，??骨小梁間隙相對較寬，這與ｍｉｃｒｏＣＴ的三維圖像相一致（圖２）。這些結果表明，與??ｓｈａｍ組相比，０ＶＸ大鼠股骨的骨量明顯減少，股骨遠端的骨微結構明顯變差。??表９去卵巢大鼠離體股骨骨密度＿（ｇ／ｃｍ２）??組別ｎ?股骨全段?股骨頭?股骨近端?股骨干?股骨遠端??ｓｈａｍ?組?１２?０．３３６２±０．?００７０?〇．２７８９±０．?００９７?〇．３８１１±０．?０２２４５?〇．３４５４±０．?０２９１?０？?３３５７±０．?０１２９??０ＶＸ?組?１２?０．２８３０±０．?０２２４＊?〇．２４７９±０．?０１８６＊?〇．３０７７±０．?０３０９＊?〇．２７８４±０．?０１９９＊?０■?２９５９±０．?０４０８＊??Ｚ?（ｔ）?－３．３１７?３．７８０?５．?１０１?５．６４８?－２．０１０??Ｐ?０．００１?０．００２?〇．〇〇〇?０．?〇〇〇?０．０４４??注：＇?與ｓｈａｍ組相比，／＞＜０．?０５。??表１０去卵巢大鼠股骨遠端骨微結構??￣ｍ＼＼?ｎ?ＢＶ／ＴＶ?（％）?ＢＳ／ＴＶ?（１／ｉｎｍ）?Ｔｂ．Ｔｈ?（ｍｍ）￣Ｔｂ．?Ｎ?（１／ｍｍ）?Ｔｂ．Ｓｐ?（ｍｍ）??２３??

㈡高通量測序數(shù)據(jù)分析??Ｉ．骨組織總ＲＮＡ質(zhì)量檢測??１０個骨組織的總ＲＮＡ樣本采用１％瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，結果如圖３Ａ所??示，各樣本的電泳條帶明亮、邊緣清晰，均可明顯看到２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ共３個條帶，??除５Ｆ、６Ｆ、８Ｆ樣本外，其他樣本均可見到２８Ｓ條帶亮度明顯強于１８Ｓ條帶。對５Ｆ、??６Ｆ、８Ｆ號骨組織重新進行總ＲＮＡ抽提，進行完整性檢測，如圖３Ｂ示２８Ｓ條帶亮度明??顯強于１８Ｓ條帶，初步說明抽提的總ＲＮＡ樣本完整性較高，無明顯降解。??２４??
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本文編號：2851981