近年來(lái),神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率逐年升高,帕金森癥(Parkinson's disease,PD)是其中的典型代表之一,多發(fā)于六十歲以上人群,年齡是PD發(fā)病的主要誘因之一,隨著人口老齡化的發(fā)展,PD的發(fā)病率預(yù)計(jì)會(huì)急劇增加。PD是一種慢性的進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)障礙,目前仍沒(méi)有較為有效的治療手段或較顯著的阻止PD病情發(fā)展的方法。PD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激是引起黑質(zhì)致密部胺能神經(jīng)元退化或病變的主要因素之一,與PD的發(fā)病有密切聯(lián)系。Farfugium japonicumi(FJ)是一種分布于東亞沿海地區(qū)的菊科植物,民間稱其為大吳風(fēng)草,在傳統(tǒng)中藥中常被用于解熱鎮(zhèn)痛抗炎。此外,在近些年的藥理學(xué)研究當(dāng)中,大吳風(fēng)草及其全提取物在抗腫瘤及抗炎方面的活性及機(jī)制也被研究及證實(shí)。在前期研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn),FJ全提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)NO水平的升高具有顯著的抑制作用,同時(shí)以粗提物分離純化后所得純品3β-angeloyloxy-8β,10β-dihydroxyeremophila-7(11)-en-12,8α-lactone(FJ1)為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)FJ1能減少LPS引起的細(xì)胞內(nèi)iNOS及nNOS的活化以及細(xì)胞內(nèi)ROS及NO水平的上升,這些都與PD發(fā)病機(jī)制有密切聯(lián)系,據(jù)此推測(cè)FJ的提取物可能具有神經(jīng)保護(hù)作用,本課題的目的是對(duì)FJ提取物神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行篩選,并選取最優(yōu)提取物,對(duì)FJ神經(jīng)保護(hù)作用的作用機(jī)制進(jìn)行探討,從而在體外評(píng)估FJ提取物用于PD預(yù)防治療的可能性。在篩選過(guò)程中,采用Griess Reagent法檢測(cè)FJ提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO生成的抑制作用,篩選出六種具有抑制NO生成作用的提取物。檢測(cè)百草枯(Paraquat,PQ)對(duì)PC12細(xì)胞及SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞毒性,用PQ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞及SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建神經(jīng)損傷模型,用MTT法初步檢測(cè)這六種提取物對(duì)PQ誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)六種化合物對(duì)PQ誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷均具有不同程度的保護(hù)作用,其中FJ1的保護(hù)作用最為顯著。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中,我們以FJ1為研究對(duì)象,檢測(cè)其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法及DAPI熒光染色觀察發(fā)現(xiàn),FJ1能通過(guò)減少PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)減弱PQ引起的神經(jīng)損傷。通過(guò)JC-1染色法檢測(cè)FJ1預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電勢(shì)變化情況,并通過(guò)Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)量,結(jié)果顯示FJ1預(yù)處理能有效抑制PQ引起的caspase-9、caspase-3的活化、Bax/Bcl-2比例的升高以及細(xì)胞色素C的釋放,并減弱PQ引起的線粒體膜電勢(shì)的降低,這些結(jié)果都表明FJ1預(yù)處理能抑制線粒體凋亡途徑的活化。此外通過(guò)DCFH-DA探針檢測(cè)FJ1預(yù)處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化,并通過(guò)SOD、GSH及MDA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH活力以及細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化水平,結(jié)果顯示FJ1預(yù)處理能維持細(xì)胞內(nèi)SOD及GSH活力,并降低細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA水平,這表示FJ1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的潛在機(jī)制可能與降低PQ引起的氧化應(yīng)激有關(guān)。綜上所述,FJ1能通過(guò)提高細(xì)胞抗氧化防御的能力,降低PQ引起的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的升高,進(jìn)而抑制PQ引起的線粒體凋亡途徑的激活,最終對(duì)PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了FJ系列化合物對(duì)PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,并探究了其抗氧化作用機(jī)制,為PD的預(yù)防及治療提供了新的依據(jù)。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)采用PQ這一應(yīng)用范圍廣的農(nóng)藥作為損傷因素,對(duì)環(huán)境學(xué)及流行病學(xué)研究都具有一定的意義。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略語(yǔ)詞匯表
第一章 緒論
    1.1 帕金森癥
    1.2 氧化應(yīng)激
    1.3 氧化應(yīng)激與PD
        1.3.1 多巴胺的新陳代謝
        1.3.2 線粒體功能障礙
        1.3.3 OS誘發(fā)細(xì)胞凋亡
        1.3.4 OS誘發(fā)神經(jīng)興奮性中毒
    1.4 PQ與PD
    1.5 帕金森模型
    1.6 前期研究
第二章 FJ系列化合物抗帕金森作用的研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞株
        2.1.2 化合物
        2.1.3 試劑
        2.1.4 主要試劑配制
        2.1.5 儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        2.2.2 MTT法檢測(cè)PQ、FJ系列化合物細(xì)胞毒性
        2.2.3 MTT法檢測(cè)FJ系列化合物對(duì)PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)損傷的保護(hù)作用
        2.2.4 Griess Reagent法檢測(cè)NO生成
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 FJ系列化合物預(yù)處理對(duì)NO的抑制作用
        2.3.2 FJ系列化合物對(duì)PC12、SH-SY5Y細(xì)胞存活率影響
        2.3.3 PQ對(duì)PC12、SH-SY5Y細(xì)胞存活率影響
        2.3.4 FJ系列化合物預(yù)處理對(duì)PQ誘導(dǎo)PC12、SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
    2.4 討論
第三章 FJ1抗帕金森作用的抗氧化機(jī)制研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞株
        3.1.2 化合物
        3.1.3 試劑
        3.1.4 主要試劑配置
        3.1.5 儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        3.2.2 MTT法檢測(cè)FJ1對(duì)PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
        3.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
        3.2.4 細(xì)胞活性氧水平（ROS）檢測(cè)
        3.2.5 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電勢(shì)（MMP）的檢測(cè)
        3.2.6 細(xì)胞內(nèi)GSH水平檢測(cè)
        3.2.7 細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)
        3.2.8 細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物檢測(cè)
        3.2.9 相關(guān)蛋白表達(dá)（Western Blot）
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 PQ對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷及FJ1的保護(hù)作用
        3.3.2 FJ1抑制PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.3.3 FJ1阻止PQ誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)的降低,并減少cytochrome c的釋放
        3.3.4 FJ1調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá),并抑制Caspase-9及Caspase-3的活化
        3.3.5 FJ1減弱PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS聚集,并減少M(fèi)DA的生成
        3.3.6 FJ1增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)
    3.4 總結(jié)及討論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間成果
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表

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本文編號(hào)：2850947