發(fā)布時間：2020-10-22 02:15

　　 近年來,神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率逐年升高,帕金森癥(Parkinson's disease,PD)是其中的典型代表之一,多發(fā)于六十歲以上人群,年齡是PD發(fā)病的主要誘因之一,隨著人口老齡化的發(fā)展,PD的發(fā)病率預(yù)計會急劇增加。PD是一種慢性的進行性運動障礙,目前仍沒有較為有效的治療手段或較顯著的阻止PD病情發(fā)展的方法。PD的發(fā)病機制較為復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激是引起黑質(zhì)致密部胺能神經(jīng)元退化或病變的主要因素之一,與PD的發(fā)病有密切聯(lián)系。Farfugium japonicumi(FJ)是一種分布于東亞沿海地區(qū)的菊科植物,民間稱其為大吳風(fēng)草,在傳統(tǒng)中藥中常被用于解熱鎮(zhèn)痛抗炎。此外,在近些年的藥理學(xué)研究當中,大吳風(fēng)草及其全提取物在抗腫瘤及抗炎方面的活性及機制也被研究及證實。在前期研究當中發(fā)現(xiàn),FJ全提取物對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細胞內(nèi)NO水平的升高具有顯著的抑制作用,同時以粗提物分離純化后所得純品3β-angeloyloxy-8β,10β-dihydroxyeremophila-7(11)-en-12,8α-lactone(FJ1)為研究對象,發(fā)現(xiàn)FJ1能減少LPS引起的細胞內(nèi)iNOS及nNOS的活化以及細胞內(nèi)ROS及NO水平的上升,這些都與PD發(fā)病機制有密切聯(lián)系,據(jù)此推測FJ的提取物可能具有神經(jīng)保護作用,本課題的目的是對FJ提取物神經(jīng)保護作用進行篩選,并選取最優(yōu)提取物,對FJ神經(jīng)保護作用的作用機制進行探討,從而在體外評估FJ提取物用于PD預(yù)防治療的可能性。在篩選過程中,采用Griess Reagent法檢測FJ提取物對LPS誘導(dǎo)的NO生成的抑制作用,篩選出六種具有抑制NO生成作用的提取物。檢測百草枯(Paraquat,PQ)對PC12細胞及SH-SY5Y細胞的細胞毒性,用PQ誘導(dǎo)PC12細胞及SH-SY5Y細胞構(gòu)建神經(jīng)損傷模型,用MTT法初步檢測這六種提取物對PQ誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的保護作用,發(fā)現(xiàn)六種化合物對PQ誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷均具有不同程度的保護作用,其中FJ1的保護作用最為顯著。進一步的實驗當中,我們以FJ1為研究對象,檢測其神經(jīng)保護作用的機制。通過Annexin V-FITC/PI雙染法及DAPI熒光染色觀察發(fā)現(xiàn),FJ1能通過減少PQ誘導(dǎo)的細胞凋亡來減弱PQ引起的神經(jīng)損傷。通過JC-1染色法檢測FJ1預(yù)處理后細胞內(nèi)線粒體膜電勢變化情況,并通過Western Blot法檢測細胞中相關(guān)凋亡蛋白的表達量,結(jié)果顯示FJ1預(yù)處理能有效抑制PQ引起的caspase-9、caspase-3的活化、Bax/Bcl-2比例的升高以及細胞色素C的釋放,并減弱PQ引起的線粒體膜電勢的降低,這些結(jié)果都表明FJ1預(yù)處理能抑制線粒體凋亡途徑的活化。此外通過DCFH-DA探針檢測FJ1預(yù)處理對細胞內(nèi)ROS水平的變化,并通過SOD、GSH及MDA試劑盒檢測細胞內(nèi)SOD、GSH活力以及細胞脂質(zhì)過氧化水平,結(jié)果顯示FJ1預(yù)處理能維持細胞內(nèi)SOD及GSH活力,并降低細胞內(nèi)ROS及MDA水平,這表示FJ1對神經(jīng)細胞保護作用的潛在機制可能與降低PQ引起的氧化應(yīng)激有關(guān)。綜上所述,FJ1能通過提高細胞抗氧化防御的能力,降低PQ引起的細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的升高,進而抑制PQ引起的線粒體凋亡途徑的激活,最終對PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷產(chǎn)生保護作用。本實驗檢測了FJ系列化合物對PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用,并探究了其抗氧化作用機制,為PD的預(yù)防及治療提供了新的依據(jù)。同時,本實驗采用PQ這一應(yīng)用范圍廣的農(nóng)藥作為損傷因素,對環(huán)境學(xué)及流行病學(xué)研究都具有一定的意義。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略語詞匯表
第一章 緒論
    1.1 帕金森癥
    1.2 氧化應(yīng)激
    1.3 氧化應(yīng)激與PD
        1.3.1 多巴胺的新陳代謝
        1.3.2 線粒體功能障礙
        1.3.3 OS誘發(fā)細胞凋亡
        1.3.4 OS誘發(fā)神經(jīng)興奮性中毒
    1.4 PQ與PD
    1.5 帕金森模型
    1.6 前期研究
第二章 FJ系列化合物抗帕金森作用的研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞株
        2.1.2 化合物
        2.1.3 試劑
        2.1.4 主要試劑配制
        2.1.5 儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        2.2.2 MTT法檢測PQ、FJ系列化合物細胞毒性
        2.2.3 MTT法檢測FJ系列化合物對PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞神經(jīng)損傷的保護作用
        2.2.4 Griess Reagent法檢測NO生成
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 FJ系列化合物預(yù)處理對NO的抑制作用
        2.3.2 FJ系列化合物對PC12、SH-SY5Y細胞存活率影響
        2.3.3 PQ對PC12、SH-SY5Y細胞存活率影響
        2.3.4 FJ系列化合物預(yù)處理對PQ誘導(dǎo)PC12、SH-SY5Y細胞損傷的保護作用
    2.4 討論
第三章 FJ1抗帕金森作用的抗氧化機制研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞株
        3.1.2 化合物
        3.1.3 試劑
        3.1.4 主要試劑配置
        3.1.5 儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存
        3.2.2 MTT法檢測FJ1對PQ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用
        3.2.3 細胞凋亡檢測
        3.2.4 細胞活性氧水平（ROS）檢測
        3.2.5 細胞內(nèi)線粒體膜電勢（MMP）的檢測
        3.2.6 細胞內(nèi)GSH水平檢測
        3.2.7 細胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測
        3.2.8 細胞脂質(zhì)過氧化物檢測
        3.2.9 相關(guān)蛋白表達（Western Blot）
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 PQ對SH-SY5Y細胞的損傷及FJ1的保護作用
        3.3.2 FJ1抑制PQ誘導(dǎo)的細胞凋亡
        3.3.3 FJ1阻止PQ誘導(dǎo)細胞線粒體膜電勢的降低,并減少cytochrome c的釋放
        3.3.4 FJ1調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達,并抑制Caspase-9及Caspase-3的活化
        3.3.5 FJ1減弱PQ誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ROS聚集,并減少MDA的生成
        3.3.6 FJ1增強細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)
    3.4 總結(jié)及討論
參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間成果
學(xué)位論文評閱及答辯情況表

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本文編號：2850947