心臟重構是心臟對一系列生理性或病理性刺激的一種反應,是心功能衰竭的獨立危險因素。探明心臟重構的病理生理學過程以減慢或逆轉它的進程,已成為心衰治療的新目標。心衰分為射血分數(shù)降低的心衰(HFr EF)或射血分數(shù)保留的心衰(HFp EF),后者在心衰群體中占比近50%。傳統(tǒng)的逆轉心臟重構的藥物如RAAS抑制藥、β受體阻斷藥等僅對部分HFr EF患者的心臟重構有效,對HFp EF患者的心臟重構療效不佳。肥胖、糖尿病、心臟壓力超負荷(如高血壓、瓣膜病)通常發(fā)展為向心性肥厚,進而發(fā)展為HFp EF的風險性更大,深入探討心臟重構的調控機制,尋找有效減慢或逆轉HFp EF心臟重構的藥物迫在眉睫。五甲基槲皮素(PMQ)在沙棘果實及山奈屬植物的根莖中含量較高,是自然界中廣泛存在的多甲氧基黃酮類化合物。試驗數(shù)據(jù)顯示PMQ具有多重藥理學效應,如抗腎臟纖維化作用、抗糖尿病及改善機體代謝作用、改善大鼠壓力超負荷及Ang II誘導的心臟重構等,但機制有待深入研究。本課題擬通過建立谷氨酸鈉誘導的肥胖(MSG-IO)模型和胸主動脈縮窄(TAC)誘導的壓力超負荷模型構建小鼠心臟重構模型,并利用異丙腎上腺素(ISO)誘導的乳鼠心肌細胞肥大模型,評價PMQ的抗心臟重構作用及機制,為尋找抗心臟重構的新靶點及藥物提供理論支持。第一部分PMQ改善MSG-IO小鼠的代謝紊亂及心臟重構目的:觀察MSG-IO小鼠的心臟重構及PMQ的心臟保護作用。方法:CD-1乳鼠出生第2 d起,皮下注射谷氨酸鈉(MSG,3 mg/g),連續(xù)7 d,每天1次。正常對照組(Control)注射等量生理鹽水。21 d后雌雄分籠飼養(yǎng)。選取雄性MSG-IO造模小鼠50只,隨機分為MSG-IO模型組、PMQ給藥組(5、10、20 mg/kg)和二甲雙胍陽性對照組(Met,300 mg/kg)。從8周齡起,Met組飼以常規(guī)飼料,將Met溶于飲水中給藥;PMQ組飼以相應濃度的含藥飼料;除Met組外,其他組均常規(guī)飲水。18周齡時口服葡萄糖耐量試驗,23周齡時測量心臟超聲心動圖,24周齡時測量各組小鼠的體重、腰圍、體長,計算Lee指數(shù),并檢測血葡萄糖和胰島素含量、計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。摘取心臟,Masson染色檢測心肌纖維化程度。結果:(1)PMQ明顯改善MSG-IO小鼠的代謝異常與Control組比,MSG-IO模型組小鼠呈現(xiàn)明顯的肥胖型2型糖尿病特征,表現(xiàn)為肥胖體征如腰圍、體重、Lee指數(shù)顯著增加,糖耐量受損,空腹血糖、血清胰島素水平、HOMA-IR均顯著升高。PMQ(5、10、20 mg/kg)劑量依賴性地改善上述各指標。PMQ(20 mg/kg)的療效與Met(300 mg/kg)相近。(2)PMQ明顯改善MSG-IO小鼠的心臟重構與Control組比,MSG-IO小鼠的左室前壁(LVAW)和室間隔(IVS)厚度明顯增厚、左室內徑(LVID)稍有減小,呈向心性肥厚特征。心臟縮小僵硬、心肌纖維化明顯。PMQ降低MSG-IO小鼠的心室壁厚度,包括收縮期和舒張期LVAW和IVS,并恢復LVID的大小;顯著降低心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù),改善心室壁的僵硬度,并抑制心肌間質纖維化程度;PMQ對左室射血分數(shù)(EF)、左室縮短分數(shù)(FS)無明顯影響。以上結果表明PMQ有效地抑制了肥胖型2型糖尿病模型心臟的向心性肥厚。PMQ(20 mg/kg)改善MSG-IO小鼠心臟重構的作用明顯優(yōu)于Met(300 mg/kg)。結論:PMQ顯著改善MSG-IO小鼠的代謝紊亂和心臟向心性重構。第二部分PMQ改善TAC誘導小鼠壓力超負荷心臟重構目的:觀察TAC誘導的小鼠心臟重構變化及PMQ的抗重構作用。方法:C57BL/6小鼠適應性喂養(yǎng)1周后(8周齡,♂),進行TAC手術誘導小鼠心臟重構。TAC術后2周時超聲心動圖檢測,與假手術組(sham)比,TAC小鼠LVAW、LVPW、IVS(包括收縮期和舒張期)均顯著增加,LVID顯著降低,確證TAC小鼠心臟出現(xiàn)典型的向心性肥厚。TAC小鼠隨機被分為5組:TAC(無干預)、TAC+Vehicle(0.1%DMSO)、TAC+PMQ 5、10、20 mg/kg/d,灌胃給藥,連續(xù)8周。TAC術后10周,超聲心動圖測量上述反映心室壁厚度和心功能的指標。宰殺后稱量臟器重量并計算臟器重量指數(shù)。形態(tài)學觀察心肌病理結構。Real-Time PCR測量心肌組織ANP、BNP、TGF-β1等心臟重構標志物的表達。結果:(1)與sham組比較,TAC術后10周,心室壁厚度顯著增加,呈向心性肥厚特征。LVID、EF、FS與sham組相比無差異;心室壁僵硬,心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)顯著增加;心肌結構紊亂,炎性細胞浸潤明顯,心肌纖維橫斷面積和纖維化程度顯著增大;心肌重構標志物如ANP、BNP、TGF-β1等m RNA表達顯著增高。TAC+Vehicle組各參數(shù)和指標與TAC組趨勢同,相比均無差異。(2)與TAC+Vehicle組相比,PMQ各劑量組不同程度地抑制心室壁的增厚,顯著降低心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù);改善心肌結構紊亂,降低心肌纖維橫斷面積和纖維化程度;顯著降低心肌ANP、BNP、TGF-β1的m RNA表達。結論:PMQ治療可顯著改善TAC誘導的小鼠心臟重構。第三部分PMQ抗心臟重構的機制研究目的:探討PMQ抗心臟重構的機制。方法:(1)MSG-IO模型和TAC模型:免疫組化法檢測心肌組織氧化應激的標志物4-HNE和8-OHd G表達,免疫熒光染色檢測Nrf2核轉位情況。其余心肌組織提取總蛋白或漿/核蛋白,分子生物學方法檢測抗氧化蛋白Sestrins及Nrf2/keap1通路蛋白的表達。(2)乳鼠心肌細胞肥大模型:分離培養(yǎng)大鼠新生乳鼠心肌細胞,ISO(10μM,24h)誘導細胞肥大模型,觀察不同濃度PMQ(1,3,10μM)抗心肌細胞肥大作用。行α-Actinin染色及Real-Time PCR檢測ANP、BNP、β-MHC等肥大標志物;Western blot檢測抗氧化蛋白Sestrins及Nrf2/keap1通路蛋白的表達,比較組間差異。采用Si RNA有效沉默Sestrin2,同樣方法檢測上述指標的變化,以確定Sestrin2是否為介導PMQ抗心臟重構的關鍵靶點。結果:(1)MSG-IO模型:與MSG-IO模型組相比,PMQ可顯著增加Sestrin 1/2、HO-1蛋白的表達,降低keap1蛋白的表達,并促進Nrf2的核轉位。(2)TAC模型:(1)與sham組比較,TAC組心肌4-HNE和8-OHd G表達均明顯升高,Sestrin2、Nrf2和HO-1蛋白表達減少,keap1蛋白表達顯著升高,且TAC+Vehicle組和TAC組相比無差異。(2)與TAC+Vehicle組相比,PMQ糾正Sestrin2、Nrf2/keap1及HO-1蛋白的表達異常。(3)乳鼠心肌細胞肥大模型:ISO刺激誘導的乳鼠心肌細胞肥大模型,Sestrin2、Nrf2、HO-1蛋白表達明顯下降,而keap1蛋白表達增高。不同濃度的PMQ干預可逆轉ISO引起的這些改變,與整體動物實驗結果相吻合。Si RNA有效沉默乳鼠心肌細胞Sestrin2后,PMQ抗心肌細胞肥大作用及調控Nrf2/keap1信號通路的作用顯著減弱。結論:PMQ抗心臟重構的作用至少是部分Sestrin2依賴性的;PMQ抗心臟重構作用與上調Sestrin2,進而增強Nrf2/keap1內源性抗氧化系統(tǒng)功能有關。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
英文縮略詞表
摘要
Abstract
前言
第一部分 五甲基槲皮素改善MSG-IO小鼠的代謝紊亂及心臟重構
    一、材料及方法
    二、實驗結果
    三、討論
第二部分 五甲基槲皮素改善TAC誘導的小鼠壓力超負荷心臟重構
    一、材料及方法
    二、實驗結果
    三、討論
第三部分 五甲基槲皮素抗心臟重構的機制研究
    一、材料及方法
    二、實驗結果
    三、討論
參考文獻
全文總結及創(chuàng)新點
綜述
    References
攻讀博士學位期間發(fā)表的論文
致謝

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本文編號：2850827