背景/目的:癌癥始終是威脅人類健康的第一大殺手。肝癌(liver cancer)是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤,臨床上會(huì)采用手術(shù)切除、肝移植和放化療等手段進(jìn)行治療,但晚期患者因癌細(xì)胞擴(kuò)散而治愈率較低,中國每年死于肝癌人數(shù)約11萬人,占全世界死亡人數(shù)的45%。乳腺癌是女性最常見的癌癥之一,盡管科技醫(yī)療水平與日俱增,全球女性的患病風(fēng)險(xiǎn)仍居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界每年死于乳腺癌的女性患者約有40萬例。因此要做到癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。蟲草素(cordycepin),別名蟲草菌素、蛹蟲草菌素等,是冬蟲夏草中主要的活性成分,一種內(nèi)源性核苷,具備了抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、清除氧自由基等多種藥理作用。雖然蟲草素顯示出良好的臨床應(yīng)用前景,但不難發(fā)現(xiàn)藥物到達(dá)病灶后存在吸收率低,溶解度差,直接給藥作用效果不佳等缺點(diǎn),本研究的目的就在于開發(fā)有效的靶向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)以提高蟲草素的溶解度和生物活性,并對(duì)該載藥系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)外的各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)。本研究主要包括以下幾個(gè)方面:1、蟲草素抗肝癌和抗乳腺癌活性評(píng)價(jià)癌細(xì)胞凋亡一直以來受到人們廣泛關(guān)注,有研究表明線粒體是凋亡的核心部位,可作為癌癥治療的有效靶點(diǎn),當(dāng)線粒體膜電位下降會(huì)進(jìn)而啟動(dòng)Caspase依賴的細(xì)胞凋亡過程MAPKs及AKT信號(hào)通路通過調(diào)控m TOR蛋白活性而抑制腫瘤生長。通過以肝癌細(xì)胞Hep G2和PLC/PRF/5以及乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231為細(xì)胞模型,分別對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞活力,細(xì)胞增殖,LDH活性,活性氧水平,線粒體膜電位變化及凋亡相關(guān)蛋白含量分析等一系列體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定,同時(shí)在裸鼠中進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),使用劑量為30mg/kg的蟲草素進(jìn)行為期兩周的藥物治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟲草素可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)癌細(xì)胞內(nèi)ROS的積累,導(dǎo)致線粒體相關(guān)凋亡蛋白含量發(fā)生變化,并且給藥后裸鼠腫瘤體積明顯降低。因此,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了蟲草素的抗癌效果,確定了蟲草素的藥用安全性。2、蟲草素脂質(zhì)體的制備及表征初步體內(nèi)代謝脂質(zhì)體是一種具有良好生物相容性的有效載體,常用于靶向輸送藥物,提高治療效果,并降低敏感器官的毒副作用。通過體外分析蟲草素脂質(zhì)體中蟲草素的HPLC方法,建立了蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,在0.1-200ug/ml的范圍內(nèi)線性良好,R2達(dá)到1,包封率為65.3%。方法學(xué)考察后發(fā)現(xiàn)其精密度、穩(wěn)定性均較好。為了增加其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,我們又建立了一個(gè)聚乙二醇脂質(zhì)中間層和靶向配體外層的多層脂質(zhì)納米粒,主要通過轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體并且包載含有蟲草素新型載藥系統(tǒng),并對(duì)蟲草素、脂質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體進(jìn)行粒徑和電位的檢測(cè)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體粒徑為125nm,較脂質(zhì)體91nm的粒徑略大,轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體電位為2.9m V,比脂質(zhì)體的9.2m V小,有顯著性差異。又通過對(duì)脂質(zhì)體、轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體進(jìn)行了體外指標(biāo)檢測(cè),均顯示出脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體都有較好的釋放速度,轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體比脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性更強(qiáng),攝取度高,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力更顯著。3、蟲草素脂質(zhì)體及轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體抗肝癌和乳腺癌活性評(píng)價(jià)利用肝癌細(xì)胞系(Hep G2和PLC/PRF/5)和乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7和MDA-MB-231)分別探究了LPs和Tf-LPs兩種不同給藥系統(tǒng)的體內(nèi)、體外抗腫瘤作用及其相關(guān)機(jī)制。采用細(xì)胞抑制試驗(yàn)、ROS水平測(cè)定、線粒體膜電位檢測(cè)、western blot、細(xì)胞攝取途徑等對(duì)LPs和Tf-LPs載藥系統(tǒng)進(jìn)行了抗腫瘤活性分析,并通過小鼠肝癌模型和乳腺癌模型進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤作用的考察。體外評(píng)價(jià)結(jié)果表明,肝癌細(xì)胞系(Hep G2和PLC/PRF/5)和乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7和MDA-MB-231)經(jīng)Tf-LPs-蟲草素組藥物作用后其IC50值明顯低于其他給藥組,并且通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tf-LPs-蟲草素組的轉(zhuǎn)染效率也明顯優(yōu)于LPs-蟲草素組。抑制劑的加入是為了更好的對(duì)藥物攝取途徑進(jìn)行探究,驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)它是以轉(zhuǎn)鐵蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮作用。由于細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累會(huì)使線粒體膜電位發(fā)生改變,并引起細(xì)胞凋亡。Tf-LPs顯著增加了細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生并誘導(dǎo)線粒體膜電位去極化。western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)Tf-LPs藥物作用后促凋亡蛋白上升趨勢(shì)顯著,抗凋亡蛋白含量減少。這表明Tf-LPs-蟲草素可以抑制兩種腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞增殖,而且通過與ROS相關(guān)的線粒體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)評(píng)價(jià)結(jié)果表明,Hep G2和PLC/PRF/5肝癌異位模型和MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌異位模型經(jīng)過14天藥物治療后,裸鼠體重變化不明顯,而Tf-LPs-蟲草素組腫瘤體積顯著下降,說明Tf-LPs能運(yùn)載更多的藥物進(jìn)去細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。因此,在對(duì)脂質(zhì)體的制備工藝和方法進(jìn)行穩(wěn)定性和安全性等考察后,又研究其在體內(nèi)外的抗腫瘤活性,結(jié)果表明蟲草素包被上轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體靶向制劑具有更好的抗腫瘤效果,為成為癌癥靶向治療的新型制劑提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

蟲草素（Cordycepin）又名蟲草菌素、3'-脫氧腺苷，是冬蟲夏草類天然藥主要活性成分[1]。蟲草素于 1950 年被首次發(fā)現(xiàn)，Cunningham 等觀察到被蛹寄生的昆蟲組織不易腐爛，繼而從蛹蟲草培養(yǎng)液中分離出一種具有抗菌活性質(zhì)，命名為蟲草素[2]。蟲草素是從真菌中分離出的第一個(gè)核苷類抗生素[3]，外學(xué)者都對(duì)其表現(xiàn)出濃厚的興趣。半個(gè)世紀(jì)以來，研究者們對(duì)蟲草素的菌株、分離提取、合成修飾、藥理活性、作用機(jī)制和產(chǎn)品研發(fā)等進(jìn)行了系統(tǒng)深入究[4, 5]。1997年蟲草素作為18種抗癌新藥之一被美國NCI引入進(jìn)行開發(fā)研究00 年美國 NCI 研發(fā)人員及國家癌癥研究所波士頓醫(yī)學(xué)中心（BMC）的教授同證實(shí)了蟲草素對(duì)白血病具有很好的藥物療效，便開始與 OXIGEN 公司尋作，經(jīng)美國 FDA 批準(zhǔn)，以蟲草素為主要成分的核苷類新藥已進(jìn)入三期臨床[6蟲草素的藥理學(xué)活性尤其是抗腫瘤機(jī)制的研究成為極其活躍的研究領(lǐng)域之多研究證實(shí)了蟲草素具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)和清除自由基種藥理活性[7]，見圖 1.1。

圖 1.2 蟲草素分子結(jié)構(gòu)式Fig 1.2 Molecular formula of cordycepin進(jìn)展水平的提高，生活節(jié)奏的加快，人類生活方受到廣泛關(guān)注。腫瘤正在成為危及人類生命種疾病中第二位，僅次于心腦血管疾病。衛(wèi)，我國癌癥年新發(fā)病例約為 200 萬，因癌癥癥治療方法主要有手術(shù)治療、放療和化療等療，局限性較大，尤其是對(duì)于癌細(xì)胞已經(jīng)擴(kuò)一種全身性治療手段，對(duì)于原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移然抗腫瘤藥物，以其副作用小、療效確切等

第一章 緒論物合成[3, 34]。蟲草素結(jié)構(gòu)與腺苷非常相似，可參與各種細(xì)胞中分子過程，例如DNA 或 RNA 的合成。它可以與腺苷 A3 受體結(jié)合從而提高 GSK-3β，降低細(xì)胞周期蛋白 D1 發(fā)揮細(xì)胞毒性。在 RNA 合成的轉(zhuǎn)錄過程中，一些酶不能區(qū)分腺苷和蟲草素，導(dǎo)致了 3’-脫氧腺苷（蟲草素）的引入，替代正常核苷，阻止了含氮堿基（A，U，G 和 C）的進(jìn)一步摻入，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程的提早終止[10, 11, 35]。Wong等[11]報(bào)道了蟲草素可以縮短 mRNA 的 polyA 尾，降低附著力并抑制細(xì)胞之間的附著。相關(guān)研究表明蟲草素可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs）關(guān)閉 mTOR 信號(hào)通路，抑制細(xì)胞翻譯、增殖和生長，具體機(jī)制尚未明確[36]。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Chang-Jiang Lei;Jia-Ni Liu;Rong Wu;Zhi-Xiong Long;Jiang-Zhou Zhang;Dan Tao;Yan-Ping Liu;;Change of the peripheral blood immune pattern and its correlation with prognosis in patients with liver cancer treated by sorafenib[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2016年06期

2 姜冀;宋央央;舒琦瑾;;中藥在腫瘤細(xì)胞凋亡途徑方面的研究進(jìn)展[J];黑龍江中醫(yī)藥;2014年02期

3 鄭素玲;王艷華;吳朝暉;;山藥對(duì)老齡小鼠免疫器官組織結(jié)構(gòu)的影響[J];中國老年學(xué)雜志;2007年19期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李文杰;莪術(shù)醇肝靶向脂質(zhì)體的制備及其抗腫瘤研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2849702