研究背景視神經(jīng)炎(Optic neuritis)是一種可導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(Retinal ganglion cell,RGC)缺失和視力障礙的常見視神經(jīng)病變,其主要的病理變化為視神經(jīng)炎癥反應(yīng)、脫髓鞘和RGCs損傷。視神經(jīng)炎的病因復雜,可以是原發(fā)性視神經(jīng)炎,也可以是由自身免疫性疾病或感染導致。視神經(jīng)炎可造成1-2周內(nèi)視力急劇下降,部分患者1-3個月內(nèi)可自行恢復,然而仍有大約半數(shù)的患者會遺留不同程度的永久性視覺功能障礙。目前,視神經(jīng)炎的治療主要運用糖皮質(zhì)固醇類藥物。然而此類藥物不能預(yù)防視神經(jīng)軸索損傷,因而無法改善視神經(jīng)炎病程中對RGC和視覺功能的損害。因此,探索具有視神經(jīng)節(jié)細胞保護功能的藥物對視神經(jīng)炎治療具有重要意義。絞股藍皂苷(Gypenosides,GPs)是傳統(tǒng)中藥材葫蘆科植物絞股藍的總皂苷,研究顯示GPs具有抗炎作用及對神經(jīng)變性疾病發(fā)揮保護作用,提示絞股藍皂苷亦可能對視神經(jīng)炎、視神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用。本實驗通過建立大鼠視神經(jīng)視網(wǎng)膜炎模型及NMDA誘導的RGC-5細胞興奮性毒性模型的研究,評估GPs對視神經(jīng)炎的治療效果以及對視神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用,并對可能的分子機制進行研究。第一部分 絞股藍皂苷對視神經(jīng)炎損傷模型大鼠視神經(jīng)及視網(wǎng)膜的保護作用目的視神經(jīng)炎是一種常見的視神經(jīng)損傷病變,視神經(jīng)任何部位發(fā)生的炎癥的總稱。分為原發(fā)性視神經(jīng)炎癥、非特異性炎癥和視神經(jīng)軸突損傷,最終可導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)缺失和視力障礙。本研究中通過向視神經(jīng)髓鞘內(nèi)注射脂多糖(LPS)建立視神經(jīng)炎損傷模型,觀察絞股藍皂甙(GPs)對視神經(jīng)組織及視網(wǎng)膜RGCs損傷后的保護作用。方法Sprague Dawley大鼠視神經(jīng)微量注射LPS誘導視神經(jīng)炎,造大鼠視神經(jīng)損傷、視網(wǎng)膜炎模型,實驗動物隨機分為對照組、視神經(jīng)炎組(ON)、ON+GPs組。視神經(jīng)炎組(ON)、ON+GPs組,觀察每組HE染色組織病理變化,免疫熒光檢測ED1/CD68、GFAP的表達情況,視神經(jīng)損傷情況應(yīng)用勒克斯堅牢藍(LFB)染色法評估視神經(jīng)的髓鞘脫失程度,TUNEL檢測視網(wǎng)膜細胞凋亡情況。結(jié)果1.GPs減輕視神經(jīng)炎損傷模型大鼠的視神經(jīng)損傷程度;2.GPs抑制視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中由LPS誘導的巨噬細胞和星形膠質(zhì)細胞的增加;3.GPs緩解LPS誘導的視網(wǎng)膜RGC損傷。結(jié)論目前的研究表明GPs顯著減弱LPS誘導神經(jīng)炎癥反應(yīng)介導的視神經(jīng)組織及視網(wǎng)膜損傷,抑制巨噬細胞激活、星形膠質(zhì)細胞增生,發(fā)揮對脫髓鞘和RGC的保護作用。GPs可以作為視神經(jīng)損傷治療藥物。第二部分絞股藍皂苷對視神經(jīng)炎炎癥因子表達及相關(guān)抗炎機制探討目的外傷或炎癥引起的視神經(jīng)的損傷,都會表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)的激活,釋放大量炎癥因子,加劇神經(jīng)損傷狀況。促炎性細胞因子TNF-α和IL-6,以及炎癥相關(guān)酶COX2和iNOS都參與視神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程,NF-κB和STAT是兩種重要的炎癥信號通路;本研究中我們檢測促炎細胞因子TNF-α、IL-6、COX2和iNOS的表達及炎癥信號NF-κB和STAT的表達變化,進一步探討GPs發(fā)揮作用的可能機制。方法Sprague Dawley大鼠視神經(jīng)微量注射LPS誘導視神經(jīng)炎,造大鼠視神經(jīng)視網(wǎng)膜炎模型,實驗動物隨機分為對照組、視神經(jīng)炎組(ON)、ON+GPs組。視神經(jīng)炎組(ON)、ON+GPs組,取新鮮組織每組Real-time PCR法檢測相關(guān)基因表達的差異,Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達差異。結(jié)果1.GPs抑制LPS誘導的視神經(jīng)炎大鼠視神經(jīng)損傷模型中促炎細胞因子TNF-α 和 IL-6、COX2 和 iNOS 的表達;2.GPs抑制LPS誘導的視神經(jīng)炎大鼠視神經(jīng)損傷模型中STAT1,STAT3和NF-κB通路的活化。結(jié)論GPs顯著減弱LPS誘導的促炎細胞因子TNF-α、IL-6和炎癥相關(guān)酶COX2、iNOS的表達,小膠質(zhì)細胞激活,星形膠質(zhì)細胞增生,脫髓鞘和RGC損失。這些作用可能與抑制NF-κB和STAT信號通路有關(guān)。第三部分 絞股藍皂苷對NMDA誘導的RGC-5細胞興奮性毒性的保護作用研究目的視神經(jīng)損傷的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)的進行性死亡和視神經(jīng)纖維的丟失,從而導致視功能發(fā)生不可逆性改變。許多N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑已被用于治療由臨床中谷氨酸興奮毒性引起的神經(jīng)退行性疾病。檢測在體外的條件下,絞股藍皂苷對NMDA誘導的RGC-5細胞的作用機理。方法NMDA(400 μM)處理RGC-5細胞建立神經(jīng)興奮性毒性損傷模型,進而細胞培養(yǎng)、傳代、計數(shù)、凍存、給藥,待用。Annexin V-FITC-PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,Real-time PCR檢測相關(guān)基因表達,ELISA檢測相關(guān)炎性因子表達。結(jié)果1.GPs抑制NMDA誘導的RGC-5細胞興奮性毒性;2.GPs抑制NMDA誘導的RGC-5細胞炎癥因子表達;3.GPs可能通過基因表達水平抑制炎癥因子表達,發(fā)揮對RGC-5細胞的護護作用。結(jié)論本研究得到GPs有效抑制NMDA誘導的RGCs細胞神經(jīng)毒性的作用,并抑制炎癥因子TNF-α,IL-6和INF-γ及促炎性酶COX2和iNOS的表達;提示GPs可能通過抑制炎癥因子的表達拮抗NMDA誘導的RGCs細胞神經(jīng)毒性。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

允由窬?姿鶘四Ｐ痛笫笫由窬?笆油?さ謀；ぷ饔茫崳?復正常，ＧＰｓ有效的減輕了視神經(jīng)損傷的炎癥表現(xiàn)（圖１）。??在ＬＦＢ染色中，可明顯觀察到在ＬＰＳ誘導的視神經(jīng)炎大鼠的視神經(jīng)中發(fā)現(xiàn)??明顯脫髓鞘現(xiàn)象；ＧＰｓ治療有效減輕視神經(jīng)脫髓鞘狀況（圖１）。表明ＧＰｓ對??ＬＰＳ誘導的視神經(jīng)炎大鼠模型有較好的保護視神脫髓鞘修復的作用。??ｃｏｎ?ＬＰＳ?ＬＰＳ＋ＧＰｓ??－－，－：Ｘ?ｒ；＇：－＼－ｖ－＇?？??ＨＥ?＾－?■５?：：?＾：；：??ｍｍｍ??圖１．?ＧＰｓ減輕ＬＰＳ誘導的視神經(jīng)炎損傷模型大鼠視神經(jīng)結(jié)構(gòu)改變和脫髓鞘。Ｈ＆Ｅ染色（上??圖）和ＬＦＢ染色（下圖）評估視神經(jīng)中的結(jié)構(gòu)變化和脫髓鞘。比例尺：５０微米。??３．２?ＧＰｓ抑制視神經(jīng)中由ＬＰＳ誘導的小膠質(zhì)細胞／巨噬細胞和星形膠質(zhì)細??胞的增加??通過免疫染色檢測ＣＤ６８和ＧＦＡＰ的表達量，反應(yīng)視神經(jīng)中的小膠質(zhì)細胞／??巨噬細胞和星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量。如圖２所示，ＬＰＳ刺激組視神經(jīng)中ＣＤ６８和??ＧＦＡＰ的熒光強度顯著增加（Ｐ?＜０．０１對比ｃｏｎ）。治療２１天的ＧＰｓ顯著降低了??兩種生物標志物的熒光強度（相對于ＬＰＳ，?Ｐ?＜０．０１）。表明，ＧＰｓ治療有效減??少視神經(jīng)炎性小膠質(zhì)細胞／巨噔細胞和星形膠質(zhì)細胞的富集，減緩炎癥反應(yīng)的發(fā)??生。??１６??

胞的增加??通過免疫染色檢測ＣＤ６８和ＧＦＡＰ的表達量，反應(yīng)視神經(jīng)中的小膠質(zhì)細胞／??巨噬細胞和星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量。如圖２所示，ＬＰＳ刺激組視神經(jīng)中ＣＤ６８和??ＧＦＡＰ的熒光強度顯著增加（Ｐ?＜０．０１對比ｃｏｎ）。治療２１天的ＧＰｓ顯著降低了??兩種生物標志物的熒光強度（相對于ＬＰＳ，?Ｐ?＜０．０１）。表明，ＧＰｓ治療有效減??少視神經(jīng)炎性小膠質(zhì)細胞／巨噔細胞和星形膠質(zhì)細胞的富集，減緩炎癥反應(yīng)的發(fā)??生。??１６??

３．３?ＧＰｓ緩解ＬＰＳ誘導的視網(wǎng)膜ＲＧＣ損傷??使用Ｈ＆Ｅ染色和Ｂｍ３ａ－ＴＵＮＥＬ雙染色檢查視網(wǎng)膜的組織學變化和ＲＧＣ損??傷。如圖３所示，ＬＰＳ注射后總視網(wǎng)膜層厚度沒有變化，但ＲＧＣｓ數(shù)量顯著減少，??并且視網(wǎng)膜中的Ｂｍ３ａ－ＴＵＮＥＬ陽性細胞顯著增加。ＧＰｓ治療２１天扭轉(zhuǎn)了這些變??化。表明ＧＰｓ對神經(jīng)炎導致的視網(wǎng)膜ＲＧＣｓ損傷發(fā)揮保護作用。??Ａ??Ｈ＆Ｅ?Ｂｍ３ａ?ＴＵＮＥＬ?ＤＡＰＩ?Ｍｅｒｇｅ??ＬＰＳ?＝?ｒ?；Ｐ?Ｃ：…??，ｘ．．‘：＇??Ｂ??２００－．?＾?２５－ｉ?２?１０１?＊＊??Ｊｌ５０－?Ｉ２０－?ｐｎ?＂＃?ｉ?８．?工??§１〇〇．?ｉ１５－?＊＊?ｎ?�。�?門＃??％?ｃ?１０．?ｒ１！?運?４．?，Ｘ??〇（／）－＊－＊??差?５〇?｜?５－?｜?２．?Ａ??〇?＃?°?一?Ｖ？％，＜。。。、？％，??圖３視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和ＲＧＣ損失情況分析。（Ａ）視網(wǎng)膜切片的Ｈ＆Ｅ和Ｂｒｎ３ａ－ＴＵＮＥＬ雙染色。??比例尺：５０微米。（Ｂ）視網(wǎng)膜厚度、ＲＧＣ數(shù)量和凋亡細胞的定量。數(shù)據(jù)以平均值＋ＳＤ表??示，ｎ?＝?６。＊＊與對照組相比，＊＊Ｐ＜０．０１，?＃＃與ＬＰＳ組相比，＃＃Ｐ＜０．０１。??１８??
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本文編號：2848560