背景及目的:卒中后抑郁(Post stroke depression,PSD)是腦卒中患者最常見(jiàn)的神經(jīng)精神性并發(fā)癥,卒中后5年內(nèi)PSD累積發(fā)生率為39-52%。PSD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,與神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)解剖、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、炎癥反應(yīng)等眾多機(jī)制參與相關(guān),近年來(lái),谷氨酸(Glu)能神經(jīng)系統(tǒng)在抑郁癥及PSD中的作用日益突出。目前臨床上缺乏針對(duì)PSD的治療藥物,主要是與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的抗抑郁藥,但是這些藥都有一定的副作用,尋找一種臨床安全有效的治療PSD的方法非常必要。卒中后抑郁在中醫(yī)學(xué)屬于“中風(fēng)”、“郁證”合病范疇。正虛為PSD的病理基礎(chǔ),氣郁、痰濁、血瘀為主要病理變化。解毒通絡(luò)顆粒(專利號(hào):201510419571.3)由人參、銀杏葉、貫葉金絲桃、川芎、天麻、黃芩和梔子七味中藥配伍而成,具有益氣活血、解毒通絡(luò)、疏肝解郁之功效,是治療卒中后抑郁氣虛血瘀證的有效復(fù)方。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合動(dòng)物模型與臨床樣本,從系統(tǒng)生物學(xué)與分子機(jī)制兩方面,從Glu興奮性毒性角度對(duì)解毒通絡(luò)顆粒的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探究,以期為解毒通絡(luò)顆粒治療PSD氣虛血瘀證提供進(jìn)一步的證據(jù)支持。方法:(1)動(dòng)物模型:采用多發(fā)腦梗復(fù)合睡眠剝奪的方法制備卒中后抑郁氣虛血瘀證大鼠模型。將50只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、氟西汀組(10mg/kg)、解毒通絡(luò)低劑量組(2g/kg)、解毒通絡(luò)高劑量組(4g/kg),共5組,每組10只,術(shù)后第一天開(kāi)始給藥,連續(xù)灌胃28天,從術(shù)后第3天開(kāi)始進(jìn)行睡眠剝奪。術(shù)前1天、術(shù)后14天、28天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)稱量體重;術(shù)后1天、14天、28天進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分;術(shù)前、術(shù)后28天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、糖水偏好實(shí)驗(yàn);術(shù)后28天檢測(cè)大鼠舌面RGB值與脈搏幅度,通過(guò)檢測(cè)這些指標(biāo)來(lái)觀察PSD氣虛血瘀證大鼠行為學(xué)與中醫(yī)證候的變化。應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法檢測(cè)對(duì)照組、模型組、解毒通絡(luò)高劑量組3組大鼠腦組織蛋白譜的變化,并進(jìn)行GO功能注釋和KEGG分析。采用ELISA試劑盒測(cè)定各組腦組織Glu、GABA含量。采用HE染色和電鏡的方法觀察大鼠海馬細(xì)胞形態(tài)變化。采用免疫組化染色法與Western blot檢測(cè)NMDAR2B、PSD95蛋白的表達(dá)情況。采用Western blot和qPCR檢測(cè)CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkB的蛋白及mRNA的表達(dá)情況。(2)臨床樣本:選取5例臨床治療有效的患者,提取治療前后靜脈血有核細(xì)胞的總RNA,采用Real-time Quantitative PCR陣列基因芯片做miRNA檢測(cè),對(duì)獲得的差異基因進(jìn)行聚類分析,GO功能注釋和KEGG通路分析。結(jié)果:(1)行為學(xué)結(jié)果:與對(duì)照組比較,模型組大鼠體重減少、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平活動(dòng)與直立活動(dòng)減少、糖水消耗率降低、懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)、神經(jīng)功能缺損加重、舌面RGB值減小、脈搏幅度降低(P0.001或P0.05)。與模型組比較,解毒通絡(luò)顆粒可增加大鼠體重、增加曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平活動(dòng)與直立活動(dòng)、增加糖水消耗率、縮短懸尾不動(dòng)時(shí)間、改善神經(jīng)功能缺損、舌面RGB值增加、脈搏幅度升高(P0.01或P0.05)。(2)蛋白組學(xué)檢測(cè):結(jié)果顯示,對(duì)照組、模型組、解毒通絡(luò)高劑量組3組共檢測(cè)到3237種蛋白,其中差異倍數(shù)在1.5倍以上的蛋白共有861種。對(duì)差異蛋白從分子功能、生物學(xué)途徑、蛋白類型3個(gè)方面進(jìn)行GO注釋,結(jié)果顯示,解毒通絡(luò)顆粒發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、受體活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、抗氧化活性等8類分子功能;骨架蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)體、細(xì)胞黏附分子等23類蛋白分子;細(xì)胞途徑、生物發(fā)生、生物調(diào)節(jié)等一系列與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及應(yīng)激作用相關(guān)的途徑。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集在與神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的代謝通路上,其中谷氨酸能突觸、γ-氨基丁酸能突觸、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路、MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等通路可能與解毒通絡(luò)顆粒對(duì)卒中后抑郁的治療作用相關(guān)。(3)腦組織病理及超微結(jié)構(gòu)觀察:通過(guò)對(duì)腦組織HE染色和電鏡觀察可見(jiàn),對(duì)照組CA3區(qū)神經(jīng)元,形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整;電鏡下細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻,線粒體嵴清晰、完整。模型組HE染色見(jiàn)海馬CA3區(qū)胞間隙增大、排列散亂,細(xì)胞數(shù)量減少,核固縮深染,出現(xiàn)變性壞死現(xiàn)象;電鏡下可見(jiàn)核固縮、染色質(zhì)邊緣聚集,線粒體變形腫脹,嵴斷裂,出現(xiàn)空泡化。解毒通絡(luò)顆粒及氟西汀可以改善海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞。(4)Glu、GABA檢測(cè):與對(duì)照組比較,模型組大鼠腦組織內(nèi)Glu水平顯著升高(P0.01),GABA水平均顯著下降(P0.05)。給藥4周后,與模型組比較,解毒通絡(luò)低、高劑量組及氟西汀組均有Glu水平顯著下降(均P0.05),GABA水平顯著升高(均P0.05)。(5)免疫組化:與對(duì)照組比較,模型組NMDAR2B陽(yáng)性表達(dá)明顯增加(P0.05),PSD95陽(yáng)性表達(dá)明顯減少且排列疏松(P0.05)。與模型組比較,解毒通絡(luò)低、高劑量組及氟西汀組有NMDAR2B陽(yáng)性表達(dá)明顯減少(均P0.05),PSD95陽(yáng)性表達(dá)明顯增加(均P0.05)。(6)WB結(jié)果:與對(duì)照組比較,模型組NMDAR2B表達(dá)水平要明顯增高(P0.05),PSD95、CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkB表達(dá)水平要明顯降低(均P0.05);與模型組比較,解毒通絡(luò)低、高劑量組及氟西汀組NMDAR2B表達(dá)水平要明顯降低(均P0.05);高劑量組及氟西汀組PSD95、CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkB表達(dá)水平有明顯升高趨勢(shì)(均P0.05),解毒通絡(luò)低劑量組PSD95、CaMKⅣ、BDNF、TrkB表達(dá)水平有明顯升高趨勢(shì)(均 P0.05)。(7)qPCR結(jié)果:與對(duì)照組比較,模型組CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkBmRNA表達(dá)量明顯減少(p0.05或p0.01);與模型組比較,解毒通絡(luò)低、高劑量組及氟西汀組CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkBmRNA 表達(dá)量均有明顯升高(p0.05 或 p0.01)。(8)miRNA表達(dá)譜芯片表達(dá):基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示,共鑒定到18個(gè)差異倍數(shù)較高的miRNA,其中有11個(gè)下調(diào)基因,7個(gè)上調(diào)基因,上調(diào)下調(diào)基因中hsa-miR-181d-5p、hsa-miR-502-3p、hsa-miR-550a-5p是鑒定到較多的靶基因。對(duì)這些靶基因進(jìn)行KEGG通路分析,發(fā)現(xiàn)差異基因作用靶點(diǎn)主要富集在谷氨酸能突觸、GABA能突觸、5-羥色胺突觸、MAPK信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路等信號(hào)通路上,這些通路主要與神經(jīng)可塑性、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖及凋亡等功能相關(guān)。結(jié)論:(1)多發(fā)腦梗復(fù)合睡眠剝奪的方法,可以成功復(fù)制出卒中后抑郁氣虛血瘀證模型,表現(xiàn)為體重下降、曠場(chǎng)活動(dòng)減少、快感缺失、懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)、舌面RGB值降低、脈搏幅度降低等核心癥狀。(2)解毒通絡(luò)顆�？筛纳拼笫笊窠�(jīng)行為學(xué)變化,增加體重、糖水消耗率及曠場(chǎng)活動(dòng)能力,減少懸尾不動(dòng)時(shí)間,改善舌面RGB值,增加脈搏幅度,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),對(duì)卒中后抑郁有一定的治療效果。(3)解毒通絡(luò)顆粒可通過(guò)調(diào)節(jié)腦組織內(nèi)Glu與GABA水平,激活NMDAR2B下游CaMKⅣ/CREB/BDNF通路,從而抑制腦缺血后興奮性神經(jīng)毒性,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。(4)動(dòng)物蛋白質(zhì)組學(xué)與臨床miRNA芯片檢測(cè),從整體角度驗(yàn)證了解毒通絡(luò)顆粒發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能與多條通路相關(guān)。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
英文縮略語(yǔ)
第一部分: 文獻(xiàn)綜述
    綜述一: 卒中后抑郁發(fā)病機(jī)制及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展
        1. 發(fā)病機(jī)制
        2. 谷氨酸及其受體與腦缺血及抑郁的關(guān)系
        3. 卒中后抑郁模型研究進(jìn)展
        4. 存在問(wèn)題與展望
        參考文獻(xiàn)
    綜述二: 卒中后抑郁治療研究進(jìn)展
        1. 西藥治療
        2. 針對(duì)谷氨酸的藥物治療
        3. 中醫(yī)藥對(duì)卒中后抑郁的治療
        4. 中醫(yī)藥治療存在問(wèn)題與展望
        參考文獻(xiàn)
前言
    參考文獻(xiàn)
第二部分: 實(shí)驗(yàn)研究
    實(shí)驗(yàn)一: 解毒通絡(luò)顆粒對(duì)卒中后抑郁氣虛血瘀證大鼠行為學(xué)的影響
        1. 材料
        2. 方法
        3. 結(jié)果
        4. 討論
        參考文獻(xiàn)
    實(shí)驗(yàn)二: 解毒通絡(luò)顆粒對(duì)卒中后抑郁氣虛血瘀證大鼠腦組織蛋白表達(dá)水平的影響
        1. 材料
        2. 方法
        3. 結(jié)果
        4. 討論
        參考文獻(xiàn)
    實(shí)驗(yàn)三: 解毒通絡(luò)顆粒對(duì)卒中后抑郁氣虛血瘀證NMDAR2B/CaMKⅣ/CREB通路的調(diào)節(jié)作用
        1. 材料
        2. 方法
        3. 結(jié)果
        4. 討論
        參考文獻(xiàn)
    實(shí)驗(yàn)四: 解毒通絡(luò)顆粒對(duì)卒中后抑郁氣虛血瘀證患者血漿miRNA的影響
        1. 臨床資料
        2. 納入/排除標(biāo)準(zhǔn)
        3. 治療方案
        4. 研究方法
        5. 生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)
        6. 醫(yī)學(xué)倫理及注冊(cè)
        7. 結(jié)果
        8. 討論
        參考文獻(xiàn)
結(jié)語(yǔ)
存在問(wèn)題與展望
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2848325