發(fā)布時間：2020-10-20 03:05

　　 紅松種鱗為我國東北地區(qū)主要針葉樹種紅松的球果鱗片,一直以來鮮有利用,對于林區(qū)廢棄物的高效利用,將其轉(zhuǎn)化為具有高活性、高附加值的產(chǎn)品,具有一定的理論價值和社會意義。本研究以紅松種鱗為研究對象,提取分離紅松種鱗多酚化合物,并對其抑制腫瘤活性進(jìn)行研究,結(jié)論如下:(1)將紅松種鱗進(jìn)行超臨界脫脂,以乙醇為提取溶劑,采用研磨珠輔助法進(jìn)行紅松種鱗多酚的提取。研究液料比、提取時間、珠填充率、珠直徑及轉(zhuǎn)速五個因素對多酚得率的影響;在此基礎(chǔ)上,以Plackett-Burman法析因,得到提取時間液料比珠填充率的主要影響因素排序;采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化工藝,得到紅松種鱗多酚最佳提取工藝為:液料比62:1,提取時間2.1h,珠填充量62%,在此提取工藝條件下,紅松多酚得率為29.09 mg/g。(2)對紅松種鱗多酚提取物進(jìn)行大孔吸附樹脂的初步分離純化。以靜態(tài)吸附率與解吸率為研究指標(biāo),篩選極性各異的七種大孔吸附樹脂,得到AB-8為最佳分離介質(zhì);考察動態(tài)洗脫條件,并以正交優(yōu)化,得到最佳純化工藝為:70%的乙醇作為洗脫液,用量為4BV,分離柱徑長比1:25,洗脫流速0.9 mL/min,在此純化條件下,紅松多酚純度由11.56%提高至39.82%。經(jīng)HPLC初步鑒定,紅松多酚成分為槲皮素(35.86%)、對香豆酸(16.58%)、水楊酸(12.41%)、沒食子酸(4.42%)、綠原酸(4.07%)、兒茶素(3.25%)、蘆丁(3.]8%)、根皮苷(3.09%)、白藜蘆醇、肉桂酸、咖啡酸、原花青素。(3)采用硅膠柱層析,選擇乙酸乙酯、正丁醇、甲醇及水配置為不同極性梯度的溶劑,依次對紅松種鱗多酚進(jìn)行洗脫分離,多酚化合物各分離部位以A549肺腺腫瘤細(xì)胞的抑制率為活性跟蹤指標(biāo),確定活性部位。共合并收集12個紅松多酚分離部位,在0.2-1.4 mg/mL濃度范圍內(nèi),通過對BEAS-2B肺上皮細(xì)胞的抑制率(CTE)考察,證實]2個多酚化合物的分離部位對于機(jī)體正常細(xì)胞均無毒性存在;對A549腫瘤細(xì)胞抑制效果最強(qiáng)的為正丁醇/甲醇(DJP)部位,與其它分離部位相比,抑制增殖效應(yīng)呈現(xiàn)顯著差異(尸0.05),該分離部位的HPLC結(jié)果表明,其中34.14%為槲皮素成分,31.27%為肉桂酸。該分離部位對于卵巢癌Hela、皮膚癌A375、結(jié)腸癌LoVo、肺腺癌A549離體細(xì)胞的增殖抑制均呈現(xiàn)顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(P0.05)。單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果表明,48h內(nèi)對于A549腫瘤細(xì)胞DNA呈現(xiàn)持續(xù)破壞作用,0.4 mg/mL濃度作用24h時達(dá)到最強(qiáng)效應(yīng),Olive尾矩為28.14±9.64,TDNA%達(dá)到 59.44%;流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),紅松多酚化合物將A549腫瘤細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。(4)建立荷瘤小鼠模型,以50、100、200 mg/kg.d劑量飼喂紅松種鱗多酚化合物,結(jié)果表明,高劑量紅松多酚的飼喂使抑瘤率達(dá)到62.23%,與環(huán)磷酰胺抗腫瘤藥物的抑瘤作用無顯著差異(P0.05);不同劑量的紅松多酚均使得荷瘤鼠的免疫器官指數(shù)顯著優(yōu)于腫瘤模型組及抗腫瘤藥物組;超敏試驗(DTH)結(jié)果顯示,高劑量紅松多酚對于DTH有極顯著抑制作用(PO.01),劑量遞減時呈現(xiàn)抑制效應(yīng)的遞減,但未呈現(xiàn)顯著差異(P0.05);脾細(xì)胞增殖抑制試驗中,可見紅松多酚與茶多酚均對脾細(xì)胞增殖有極顯著促進(jìn)作用(PO.W);高劑量紅松多酚對碳粒廓清效果極顯著,同樣在高劑量飼喂水平組的血清TNF-α及IL-2含量亦顯著高于腫瘤模型組(P0.05)。在小鼠機(jī)體氧化酶系的考察中發(fā)現(xiàn),紅松多酚對于小鼠肝、腦、腎組織中的T-SOD酶活有顯著促進(jìn),同時顯著降低MDA含量(P0.05);高劑量的紅松多酚對CAT酶活有顯著上調(diào)效應(yīng),對腦、肝組織中的GSH-Px酶活有提高,且顯示出顯著的劑效差異(PO.05)。(5)采用腫瘤組織的免疫組化技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察方法,對紅松種鱗多酚抑瘤途徑進(jìn)行研究。通過HE染色后的形態(tài)學(xué)觀察,可見不同劑量紅松多酚的飼喂,對于腫瘤組織的細(xì)胞產(chǎn)生明顯的損傷,單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果表明,紅松多酚化合物可在72h內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用,呈現(xiàn)劑量、時間的依賴關(guān)系(P0.05),Olive尾矩35.96士6.48,TNDA%達(dá)到71.12±9.82%,細(xì)胞周期被阻滯于G2/M期。TNUEL檢測印證紅松種鱗多酚對于腫瘤組織細(xì)胞凋亡的程度存在劑效趨勢;Caspase-9及-Caspase 3在不同組別中極顯著地呈現(xiàn)表達(dá)上的一致性(P0.0W),高劑量下紅松多酚對于Caspase-9的表達(dá)極顯著優(yōu)于其它組別。SHH通路的Ptch-1及Gli-I兩種基因蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)r=0.945,為極顯著相關(guān)(P0.01),紅松多酚對于兩者的表達(dá)起到抑制作用,且呈現(xiàn)出顯著下調(diào)的劑量效應(yīng)關(guān)系;Notch信號通路的Notch-1及Hes蛋白被同時陽性檢出,二者極顯著相關(guān),不同劑量的紅松多酚作用下,Hes轉(zhuǎn)錄因子表現(xiàn)出顯著下調(diào)的的效應(yīng)關(guān)系(P0.05)。說明紅松多酚極可能成為腫瘤細(xì)胞SHH通路及Notch信號通路的活性抑制劑。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R284;R285
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 課題背景
    1.2 國內(nèi)外相關(guān)研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢
        1.2.1 多酚類化合物
        1.2.2 植物多酚的提取分離技術(shù)
        1.2.3 植物多酚抗腫瘤研究
    1.3 本研究內(nèi)容
    1.4 本研究工藝路線
2 研磨珠法提取紅松種鱗多酚工藝研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 試驗方法
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 建立多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線
        2.2.2 脫脂方案的確定
        2.2.3 單因素對紅松種鱗多酚提取得率的影響
        2.2.4 Plackett-Burman法篩選紅松種鱗多酚得率的顯著影響因素
        2.2.5 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化紅松種鱗多酚提取工藝
    2.3 討論
    2.4 本章小結(jié)
3 紅松種鱗多酚純化最佳工藝參數(shù)的優(yōu)化
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 試驗方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 固相介質(zhì)的篩選
        3.2.2 靜態(tài)吸附條件的確定
        3.2.3 動態(tài)洗脫單因素試驗
        3.2.4 正交優(yōu)化動態(tài)洗脫條件
        3.2.5 紅松種鱗多酚化合物的組分分析
    3.3 討論
    3.4 本章小結(jié)
4 紅松種鱗多酚的活性部位分離及對腫瘤細(xì)胞的活性跟蹤
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗材料
        4.1.2 試驗方法
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 硅膠柱層析分級紅松種鱗多酚
        4.2.2 紅松多酚不同分級部位對BEAS-2B肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒作用
        4.2.3 紅松種鱗多酚不同分級部位對A549肺腺腫瘤細(xì)胞的抑制作用
        4.2.4 紅松種鱗多酚(DJP)對4種腫瘤細(xì)胞抑制的劑量、時間依賴關(guān)系
        4.2.5 單細(xì)胞凝膠電泳評價紅松種鱗多酚對A549腫瘤細(xì)胞的DNA損傷
        4.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測紅松種鱗多酚誘導(dǎo)A549腫瘤細(xì)胞凋亡
    4.3 討論
    4.4 本章小結(jié)
5 紅松種鱗多酚對荷瘤小鼠生理功能的影響
    5.1 材料與方法
        5.1.1 試驗材料
        5.1.2 試驗方法
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 荷瘤鼠的生長狀況
        5.2.2 小鼠的體重變化曲線
        5.2.3 紅松種鱗多酚對荷瘤鼠的抑瘤率
        5.2.4 紅松多酚對荷瘤鼠免疫器官指數(shù)的影響
        5.2.5 紅松多酚對荷瘤小鼠外周血指標(biāo)的影響
        5.2.6 紅松多酚對荷瘤鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的影響
        5.2.7 紅松種鱗多酚對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響
        5.2.8 小鼠的碳粒廓清作用
        5.2.9 紅松種鱗多酚對荷瘤鼠血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響
        5.2.10 紅松多酚對荷瘤小鼠血清中白細(xì)胞介素(IL-2)的影響
        5.2.11 荷瘤鼠體內(nèi)總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力的變化
        5.2.12 荷瘤鼠體內(nèi)丙二醛(MDA)含量的變化
        5.2.13 荷瘤鼠體內(nèi)谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-P_x)活力的變化
        5.2.14 荷瘤鼠體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活力的變化
    5.3 討論
    5.4 本章小結(jié)
6 紅松種鱗多酚對腫瘤抑制的機(jī)制研究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 試驗材料
        6.1.2 試驗方法
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 HE染色結(jié)果
        6.2.2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡
        6.2.3 Caspase-9及/Caspase-3的表達(dá)
        6.2.4 紅松多酚對SHH信號通路Ptch-1、Gli-1的表達(dá)影響
        6.2.5 紅松多酚對Notch信號通路Notch-1、Hes的表達(dá)影響
    6.3 討論
    6.4 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2848115