心肌缺血是危害人類健康的主要疾病之一,由其導(dǎo)致的心肌梗死更是引起患者死亡的重要原因。心肌缺血可致氧自由基大量增加,氧化應(yīng)激又可進(jìn)一步加重心肌缺血性損傷;而心肌梗死后的心室重塑及纖維化更是導(dǎo)致心功能下降的主要病理基礎(chǔ)。心肌細(xì)胞肥大、炎癥和纖維化被認(rèn)為是心肌梗死后組織進(jìn)行代償修復(fù)最主要病理特征,這種特征又可導(dǎo)致心功能的進(jìn)一步下降,從而引發(fā)惡性循環(huán)。因此,尋找安全有效的防治心肌缺血損傷及阻止缺血后心室重塑和纖維化的藥物具有重要意義。大蒜辣素是國際公認(rèn)的大蒜主要活性物質(zhì),國內(nèi)一直將大蒜素作為大蒜的主要活性成分,因此對大蒜辣素的研究較少。大蒜辣素是一種具有多種生物活性的藥物,許多研究證實其具有抑制細(xì)胞凋亡、抗炎、抗氧化等作用。本研究主要研究大蒜辣素對急性心肌缺血的即刻保護(hù)作用及長期應(yīng)用對梗死后心室重塑和心肌纖維化的防治作用,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了大蒜辣素對心肌成纖維細(xì)胞功能及其電生理的影響,為大蒜辣素應(yīng)用于臨床提供實驗依據(jù)。目的1.明確大蒜辣素對急性心肌缺血大鼠的心肌保護(hù)作用及對缺血后氧化應(yīng)激的對抗作用。2.研究大蒜辣素長期應(yīng)用對大鼠心肌缺血后心室重塑和心功能的影響,并明確其對梗死后心肌纖維化的干預(yù)作用及其與TGFβ/Smads信號通路的關(guān)系。3.闡明大蒜辣素對大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖分化及膠原分泌的的影響,并進(jìn)一步明確大蒜辣素對心肌成纖維細(xì)胞中電導(dǎo)鈣激活鉀通道(KCa3.1)電流及通道的影響。方法1.大蒜辣素對急性心肌梗死大鼠的心肌保護(hù)作用70只wistar大鼠隨機(jī)分為七組:空白對照組、假手術(shù)組、模型組、地爾硫?組(1.5mg/kg)、大蒜辣素低(1.2mg/kg)、中(1.8mg/kg)、高(3.6mg/kg)劑量組。除空白組和假手術(shù)組外,其余各組大鼠均采用冠狀動脈結(jié)扎方法復(fù)制大鼠心肌缺血模型,術(shù)后即刻尾靜脈注射相應(yīng)藥物,24h后處死大鼠,取心臟及血清檢測以下指標(biāo):血清肌鈣蛋白Ⅰ(cTnI)、肌紅蛋白(Mb)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、CAT、GSH-Px水平;NBT染色檢測心肌梗死范圍。2.大蒜辣素對大鼠心肌梗死后心室重塑和心肌纖維化防治作用Wistar大鼠60只,隨機(jī)分為六組:假手術(shù)組、模型組、地爾硫?(1.5mg/kg)組和大蒜辣素低劑量組(1.2mg/kg)、中劑量組(1.8mg/kg)、高劑量組(3.6mg/kg)。除假手術(shù)組外,其余各組冠狀動脈結(jié)扎法復(fù)制大鼠心肌缺血模型,假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。模型制作成功后第二天各組開始腹腔注射相應(yīng)藥物,連續(xù)給藥21天。21天后,小動物超聲檢測大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的變化;Masson染色觀察心臟纖維組織變化;免疫組化檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGFβ1/Smads信號途徑相關(guān)蛋白TGFβ1、Smad3和Smad7的表達(dá)表達(dá)情況。3.大蒜辣素對大鼠心肌成纖維細(xì)胞的作用及機(jī)制采用差速貼壁法體外分離培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞,將細(xì)胞分為正常對照組、AngⅡ組,大蒜辣素低(0.2μM)、中(1μM)、高(5μM)劑量組。除正常對照組外,其余組利用AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖分化,大蒜辣素各劑量組同時給予大蒜辣素干預(yù)。24h后檢測以下指標(biāo):倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;MTS檢測各組細(xì)胞增殖情況;免疫熒光染色檢測細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)以確定其分化;qRT-PCR和Western blot檢測成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達(dá);膜片鉗技術(shù)記錄心肌成纖維細(xì)胞Kca3.1電流密度,并應(yīng)用qRT-PCR和Western blot確定大蒜辣素對KCa3.1mRNA和蛋白表達(dá)的影響;在此基礎(chǔ)上利用H2S合成酶抑制劑PAG進(jìn)一步確定H2S信號途徑與大蒜辣素作用的關(guān)系。結(jié)果1.大蒜辣素對急性心肌梗死大鼠的心肌保護(hù)作用(1)心肌梗死范圍和血清標(biāo)志物與模型組比較,地爾硫?及大蒜辣素低、中、高劑量均顯著降低心肌梗死大鼠模型的心肌梗死范圍(P0.01);模型組大鼠血清cTn-Ⅰ水平較假手術(shù)組和空白組顯著升高(P＜0.01),地爾硫?組、大蒜辣素中、高劑量組血清cTn-Ⅰ水平較模型組顯著降低(P0.05),但大蒜辣素低劑量組血清cTn-Ⅰ水平與模型組比較差異無顯著性(P0.05);與模型組比較,各藥物治療組血清CK-MB和Mb水平均有降低趨勢,但各組CK-MB水平差異無顯著性,只有大蒜辣素高劑量組血清Mb水平與模型組比較差異有顯著性(P0.05)。(2)氧化應(yīng)激指標(biāo)模型組大鼠SOD和GSH-Px較空白對照組和假手術(shù)組均有降低趨勢,而地爾硫?組和大蒜辣素低、中、高劑量組血清SOD和GSH-Px水平較模型組也有升高趨勢,但各組間差異均不顯著(P0.05);模型組CAT水平較假手術(shù)組顯著升高(P0.01),地爾硫草組和大蒜辣素各劑量組與模型組比較顯著降低(P0.05);而對于血清MDA水平,模型大鼠血清MDA較假手術(shù)組明顯增高(P0.05),應(yīng)用地爾硫?和大蒜辣素治療后,血清MDA水平均有降低趨勢,但只有大蒜辣素中、高劑量組與模型組比較差異具有顯著性(P0.05)。2.大蒜辣素對大鼠心肌梗死后心室重塑和心肌纖維化防治作用(1)大鼠超聲心動圖結(jié)果大蒜辣素各劑量組左室前壁厚度(LVAWd/s)均較模型組顯著增加(P ＜0.05)。而左室后壁厚度(LVPWd/s)各組之間無顯著差異(P0.05)。同時,大蒜辣素各劑量組還可減小收縮期左室內(nèi)徑(LVIDd/s)。通過對射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)、每搏輸出量(SV)計算結(jié)果顯示,大蒜辣素可明顯改善心功能,EF、FS和SV水平較模型組顯著增高(P0.05)。(2)心肌Masson染色及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)結(jié)果Masson染色顯示,模型組大鼠心臟纖維組織顯著增多,而各藥物治療組心臟纖維組織減少;免疫組化結(jié)果顯示:模型組大鼠心肌纖維化明顯,Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)量較假手術(shù)組顯著增加(P0.05),大蒜辣素各劑量組均可抑制心肌纖維化發(fā)展,顯著減少Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)(P0.05)。(3)TGFβ/mads通路信號蛋白表達(dá)變化與正常組比較,模型組大鼠心肌中TGF-β1、Smad3表達(dá)顯著增加(P＜0.05),Smad7表達(dá)顯著減少(P0.05)。與模型組比較,大蒜辣素中、高劑量組顯著抑制大鼠非梗死區(qū)心肌中TGF-β1和Smad3的表達(dá)(P＜0.05),而Smad7的表達(dá)增加(P0.05),大蒜辣素低劑量組與模型組比較差異無顯著性(P0.05)。3.大蒜辣素對大鼠心肌成纖維細(xì)胞的作用及機(jī)制(1)對心肌成纖維細(xì)胞增殖分化的影響在細(xì)胞形態(tài)學(xué)水平,細(xì)胞貼壁生長,為星形扁平細(xì)胞,無自發(fā)性搏動。24h后正常對照組細(xì)胞較稀少,經(jīng)AngⅡ刺激后,細(xì)胞數(shù)量增多,大蒜辣素各劑量組細(xì)胞數(shù)量較AngⅡ組明顯較少;MTS結(jié)果顯示,與正常組心肌成纖維細(xì)胞比較,AngⅡ組細(xì)胞活力顯著增高,而大蒜辣素高、中、低劑量干預(yù)24h后細(xì)胞活力較AngⅡ組細(xì)胞活力顯著降低(P0.01);免疫熒光染色結(jié)果顯示,AngⅡ作用24h后,心肌成纖維細(xì)胞α-SMA表達(dá)較正常組明顯增強(qiáng),而給予大蒜辣素干預(yù)后,α-SMA表達(dá)量較AngⅡ組明顯降低。提示大蒜辣素可抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖分化。(2)心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)變化qRT-PCR與Western blot結(jié)果顯示,AngⅡ刺激后,成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)量較正常對照組明顯升高(P0.05)。與AngⅡ組比較,大蒜辣素高劑量組和大蒜辣素中劑量組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低,差異有顯著性(P＜0.01),但大蒜辣素低劑量組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)量與AngⅡ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)大蒜辣素對心肌成纖維細(xì)胞KCa3.1的影響①首先應(yīng)用膜片鉗記錄了大蒜辣素對全細(xì)胞鉀電流的影響,結(jié)果顯示,AngⅡ組細(xì)胞全細(xì)胞鉀電流的電流密度顯著升高,而大蒜辣素高劑量組可顯著抑制全細(xì)胞鉀電流的電流密度,低劑量組和中劑量組電流密度與AngⅡ組比較無顯著差異;應(yīng)用電流密度繪制鉀通道的激活曲線,顯示大蒜辣素對鉀離子通道的激活性質(zhì)并無影響。②KCa3.1在心肌成纖維細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮了重要作用,為證明大蒜辣素所影響的鉀電流是否有KCa3.1,在記錄全細(xì)胞鉀電流后急性加入KCa3.1特異性阻斷劑TRAM-34進(jìn)行觀察,所記錄到的電流即為TRAM-34不敏感鉀電流。用全細(xì)胞鉀電流減去TRAM-34不敏感鉀電流得到TRAM-34敏感鉀電流,即為KCa3.1電流。與正常組比較,AngⅡ可顯著升高大鼠心肌成纖維細(xì)胞KCa3.1的鉀離子電流密度,應(yīng)用大蒜辣素干預(yù)后,大蒜辣素高劑量組電流密度較AngⅡ組顯著降低(P0.05)。繪制各組細(xì)胞KCa3.1的激活曲線顯示大蒜辣素對KCa3.1離子通道的激活性質(zhì)無顯著影響,說明大蒜辣素抑制KCa3.1鉀電流并非通過影響離子通道的激活性質(zhì)實現(xiàn),可能通過其他機(jī)制影響KCa3.1。(4)心肌成纖維細(xì)胞KCa3.1 mRNA及蛋白表達(dá)變化為確定大蒜辣素影響KCa3.1的機(jī)制,應(yīng)用qRT-PCR和Western blot檢測了KCa3.1 mRNA及蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示,AngⅡ可顯著上調(diào)心臟成纖維細(xì)胞KCa3.1離子通道m(xù)RNA和蛋白表達(dá)(P0.01),而大蒜辣素各劑量組成纖維細(xì)胞KCa3.1離子通道m(xù)RNA和蛋白表達(dá)較AngⅡ組顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(5)大蒜辣素下調(diào)KCa3.1作用與H2S信號通路的關(guān)系H2S是具有心臟保護(hù)及抗纖維化作用的信號分子,大蒜辣素可作為H2S供體發(fā)揮心肌保護(hù)作用。通過應(yīng)用H2S合成酶抑制劑PAG發(fā)現(xiàn),PAG可顯著抑制大蒜辣素對KCa3.1 mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。加入PAG后,大蒜辣素下調(diào)KCa3.1表達(dá)的作用被取消,與大蒜辣素組比較差異有顯著性(P0.05),說明大蒜辣素對KCa3.1的調(diào)節(jié)作用與H2S信號通路有關(guān)。結(jié)論1.大蒜辣素在大鼠心肌梗死造模后即刻給藥能對缺血心肌產(chǎn)生保護(hù)作用,可明顯減小心肌梗死范圍、降低血清心肌梗死標(biāo)志物水平并改善氧化應(yīng)激指標(biāo)。2.大蒜辣素在心肌梗死造模后長期給藥可抑制心室重塑、改善心功能,同時也可抑制心肌纖維化的發(fā)展,其機(jī)制與調(diào)節(jié)TGFβ/Smads信號通路有關(guān)。3.大蒜辣素在細(xì)胞水平可抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖分化,減少心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。4.大蒜辣素還可抑制心肌成纖維細(xì)胞Kca3.1電流密度,這一作用與影響KCa3.1的激活性質(zhì)無關(guān),而是通過下調(diào)細(xì)胞KCa3.1通道表達(dá)而實現(xiàn)。大蒜辣素對KCa3.1通道的調(diào)節(jié)作用與H2S信號途徑有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

血清Ｍｂ水平在模型組顯著升高，差異有顯著性（Ｐ＜０．０１），而各藥物治療??組血清Ｍｂ水平有降低趨勢，但只有大蒜辣素高劑量組與模型組比較差異有顯著??性（ＰＣ０．０５）。見表１、圖１、圖２、圖３。??表１大蒜辣素對各組大鼠血淸ｃＴｎ－Ｉ、ＣＫ－ＭＢ、Ｍｂ水平的影響??組別?ｎ?ｃＴｎｉ?ＣＫ－ＭＢ?Ｍｂ??空白對照組?１０?１８５＿５１士２８．６６?１１．２０±３．１４?１９９４．８５±３１５．７５￣??假手術(shù)組?１０?２０５．５９ｉ３３．０４?】１．５３±２．丨４?２１３７．５３±４８３．１０??模型組?１１?２６８．９５±３５．７４＃?１４．０２±２．９５?２８３４．５６±５３９．６３＃??地爾硫草組?１０?２４６．０８±２７．７１＊＊?１２．６４±２．００?２２９７．０４±２５８．２２??大蒜辣素低劑量組?８?２５１．５６±３５．５７?１３．０１±１．７５?２４６２．７０±３８６．３１??大蒜辣素中劑量組?１２?２４７．２１?±４２．５５＊?１２．７４±１．２９?２４０８．９４土５３８．６８??大蒜辣素高劑量組?９?２２８．３９±４１．８８＊?１２．１９±２．１４?２２４１．３０±５６６．９６＊＊??注：＃與假手術(shù)組比較戶＜０．０１，?＊與模型組比較Ｐ＜０．０丨，＊＊與模型組比較戶＜０．０５??４７??

模型組大鼠ＳＯＤ和ＧＳＨ－Ｐｘ較空白對照組和假手術(shù)組均有降低趨勢，而地爾硫??罩組和大蒜辣素低、中、高劑量組血清ＳＯＤ和ＧＳＨ－Ｐｘ水平較模型組也有升高??趨勢，但各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＞〇．〇５）。（見表２、圖４、圖５）??ＣＡＴ也為抗氧化酶，模型組大鼠血清ＣＡＴ水平較空白對照組和假手術(shù)組顯??著降低（戶＜〇．〇１），經(jīng)藥物治療后各組血清ＣＡＴ水平顯著高于模型組，其中地爾??硫罩組和大蒜辣素中劑量組與模型組比較（尸＜〇．〇１），大蒜辣素高劑量組和中劑??量組ＣＡＴ水平與模型組比較（Ｐ＜０．０５）。（見表２、圖６）??血清ＭＤＡ水平直接反映心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度，間接反映心肌細(xì)胞氧化??損傷的程度。檢測結(jié)果顯示，心肌梗死模型大鼠血清ＭＤＡ較假手術(shù)組明顯增高，??應(yīng)用地爾硫罩和大蒜辣素治療后，血清ＭＤＡ水平均有降低趨勢，但只有大蒜辣??素中、高劑量組與模型組比較差異具有顯著性（尸＜〇．〇５）。（見表２、圖７）??４９??

圖７大蒜辣素對大鼠血清ＭＤＡ水平的影響??術(shù)組比較尸＜０．０１，?＊與模型組比較ＰＣ０．０１，＊＊與模型組比較尸＜范圍變化??范圍測定是反映心肌梗死程度的最直接的指標(biāo)。對各組大鼠的結(jié)果顯示，空白對照組和假手術(shù)組大鼠心臟未發(fā)現(xiàn)心肌范圍較大，平均值為４２．１１％。經(jīng)過藥物治療后，地爾硫罩組高劑量組大鼠心肌梗死區(qū)范圍較模型組明顯減少（Ｐ＜０．０１）梗死范圍無顯著差異（戶＞０．０５）。（見表３、圖８、圖９）??
【參考文獻(xiàn)】

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1 吳祖波;彭華;白燕;林雯;張志泉;劉亞黎;;GYY4137通過Bcl-2/Bax/Cleaved caspase-3信號通路改善柯薩奇病毒B_3引起的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞凋亡[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2014年04期

2 沈祥春;楊鈺萍;徐旖旎;許立;方泰惠;;基于TGF-β-Smads信號的氧化苦參堿干預(yù)急性心肌梗死誘發(fā)實驗性大鼠心肌纖維化的研究[J];中國中藥雜志;2012年05期

3 徐穎;尹宗寧;;蒜氨酸、蒜酶及其混合物的體外抗氧化活性研究[J];華西藥學(xué)雜志;2011年04期

4 張國華;;溫膽湯對SHR大鼠血液中ALDO和AngⅡ水平的影響[J];現(xiàn)代醫(yī)院;2007年05期

5 張海嘯;史載祥;;轉(zhuǎn)化生長因子-β信號傳導(dǎo)通路與心肌纖維化[J];中日友好醫(yī)院學(xué)報;2007年02期

6 程志清;忻尚平;;通心絡(luò)對病毒性心肌炎慢性期小鼠心肌纖維化細(xì)胞因子TGF、PDGF表達(dá)的影響[J];中國中醫(yī)藥科技;2007年02期

7 趙艷峰;徐江;湯劍青;王虹;上官海娟;官洪山;;當(dāng)歸對大鼠心肌梗死后心肌纖維化的影響及機(jī)制[J];中國病理生理雜志;2006年10期

8 潘柏申;楊振華;吳健民;;冠狀動脈疾病和心力衰竭時心臟標(biāo)志物臨床檢測應(yīng)用建議[J];中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2006年09期

9 付鵬;牛鐵生;姜春力;;一種慢性心肌梗死大鼠動物模型的建立方法[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2006年05期

10 沈雁,曹洪欣;溫陽活血化痰法抗心肌纖維化作用及機(jī)制研究[J];遼寧中醫(yī)雜志;2005年06期

本文編號：2846125