發(fā)布時(shí)間：2020-10-17 00:54

　　 目的:觀察淫羊藿苷(Icariin,ICA)對6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:(1)在96孔板中接種PC12細(xì)胞(1×10~5/孔),24小時(shí)后加6-OHDA/ICA處理,MTT法篩選6-OHDA及ICA濃度。(2)確定6-OHDA及ICA濃度后,細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、6-OHDA組、6-OHDA+ICA低劑量組和6-OHDA+ICA高劑量組。ICA預(yù)處理24小時(shí)后,加入6-OHDA處理24小時(shí),流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的含量及早期凋亡率;SOD試劑盒測定SOD水平;蛋白免疫印跡法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase 3、Cytochrome C的表達(dá)。(3)采用Nrf2-siRNA(40 nmol/L)轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,首先用蛋白免疫印跡法和Nrf2免疫熒光染色檢驗(yàn)沉默/抑制效率,再用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的含量及早期凋亡率;SOD試劑盒測定SOD水平;蛋白免疫印跡法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase 3、Cytochrome C的表達(dá)。結(jié)果:(1)MTT結(jié)果顯示6-OHDA從100μM濃度開始具有細(xì)胞毒性作用,與空白組比較,模型組ROS及早期凋亡率明顯增高,SOD表達(dá)明顯降低,凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值、Caspase 3、Cytochrome C表達(dá)明顯升高,Nrf2、Keap1及其下游蛋白HO-1、NQO1、GCLC表達(dá)升高;經(jīng)ICA處理后,ROS明顯降低,SOD表達(dá)明顯升高,凋亡蛋白Bax/Bcl-2的比值,Caspase 3、Cytochrome C表達(dá)明顯降低,Keap1表達(dá)降低,Nrf2及其下游蛋白HO-1、NQO1、GCLC表達(dá)進(jìn)一步升高。(2)經(jīng)Nrf2-siRNA處理PC12細(xì)胞后,再次加入ICA,ICA的神經(jīng)保護(hù)作用消失,且ROS、SOD、氧化相關(guān)蛋白Keap1、核內(nèi)Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase 3、Cytochrome C蛋白表達(dá)及早期凋亡率與模型組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:ICA保護(hù)6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷部分通過調(diào)控Nrf2信號通路。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1. ICA 減輕 6-OHDA 誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷( x ±SEM, n=3). 與空白組比*P<0.05，與 6-OHDA 組#P<0.05.Fig.1 ICA protected against 6-OHDA-induced neuronal damage ( x±SEM, n=3). *P<0.05 vscontrol;#P<0.05 vs 6-OHDA2.2 ICA減輕6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激如圖 2 所示，與空白組比較，模型組 ROS 水平升高、SOD 活性降低；給予 IC后，ROS 釋放量降低，SOD 升高（Fig. 2A& B）。此外，與模型組比較，ICA 處理后，胞漿 Nrf2 表達(dá)降低、胞核 Nrf2 表達(dá)增加（Fig. 2C）；Keap1 表達(dá)降低，Nrf2游蛋白 HO-1、NQO1、GCLC 的表達(dá)增高 （Fig. 2D）。

圖 2. ICA減輕6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激( x±SEM, n=3). 與空白組比*P<0.05，與6-OHDA比#P<0.05.Fig.2 ICA attenuated 6-OHDA-induced oxidative stress ( x±SEM, n=3). *P<0.05 vs control;#P<0.05 vs 6-OHDA2.3 ICA 對 6-OHDA 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 Nrf2 的 PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響用 siRNA 沉默 Nrf2，熒光染色及 Western blot 結(jié)果均顯示沉默率約為 70%（Fi3A）。沉默 Nrf2 后，與空白組比較，模型組 ROS 升高，SOD 表達(dá)降低；與 6-OHD組比較，給予 ICA 后，ROS 及 SOD 的表達(dá)均無改善（Fig. 3B & C）。Western bl檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，6-OHDA 組 Keap1，HO-1， NQO1 表達(dá)增加；經(jīng) IC處理后，Keap1，HO-1， NQO1 表達(dá)與 6-OHDA 組無明顯變化（Fig. 3D）。

圖 3. ICA 對 6-OHDA 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 Nrf2 的 PC12*P<0.05，與 6-OHDA 組比#P<0.05.Fig.3 Knockdown of Nrf2 abolished ICA-mediatvs control;#P<0.05 vs 6-OHDA2.4 ICA 對 6-OHDA 誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 Nr用 siRNA 沉默 Nrf2 后，MTT 結(jié)果護(hù)作用（Fig. 4A）。流式細(xì)胞儀檢測模型Blot 結(jié)果顯示模型組的凋亡基因 Bax/bc高；ICA 處理組 Nrf2 沉默后，細(xì)胞早期Caspase 3 的表達(dá)與 6-OHDA 組無顯著差
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本文編號：2844030