本草基因組學(xué)(Herbgenomics)是利用組學(xué)技術(shù)研究中藥基原物種的遺傳信息及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從組學(xué)水平研究中藥及其與人體相互作用,闡明中藥預(yù)防和治療人類疾病的分子機(jī)制的前沿學(xué)科,其主要研究?jī)?nèi)容涉及理論體系、關(guān)鍵技術(shù)及實(shí)踐應(yīng)用等方面。本研究將DNA條形碼鑒定、宏基因組測(cè)序和單分子測(cè)序等關(guān)鍵技術(shù)應(yīng)用于中藥鑒定領(lǐng)域,構(gòu)建長(zhǎng)白山區(qū)藥用植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫并建立中成藥質(zhì)量控制新方法。中藥材DNA條形碼分子鑒定需要強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫作為支撐,并持續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)更新、擴(kuò)充及維護(hù);中成藥質(zhì)量參差不齊,《中國(guó)藥典》現(xiàn)行方法難以滿足當(dāng)前對(duì)中成藥生物組分監(jiān)測(cè)需求,因此迫切需要建立中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)新方法。本研究基于本草基因組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù),采用不同測(cè)序平臺(tái)對(duì)長(zhǎng)白山區(qū)藥用植物及中成藥進(jìn)行鑒定,主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下:1.建立長(zhǎng)白山區(qū)藥用植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫:長(zhǎng)白山區(qū)是北半球同緯度地區(qū)保存比較完好的生態(tài)系統(tǒng),是我國(guó)北方藥用植物資源分布較為集中的區(qū)域,也是東北亞地區(qū)最大的藥用植物種質(zhì)基因庫。對(duì)長(zhǎng)白山區(qū)藥用植物資源進(jìn)行調(diào)查,共收集來自107個(gè)科400個(gè)屬678個(gè)物種總計(jì)1,877份樣本。有19個(gè)屬采集到5個(gè)以上物種,隨機(jī)篩選其中8個(gè)屬共計(jì)55個(gè)物種158份樣本,比較ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL四種最常用DNA條形碼序列的鑒定效率,確定以ITS2和psbA-trnH序列為主體構(gòu)建長(zhǎng)白山區(qū)藥用植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。實(shí)驗(yàn)獲得ITS2、psbA-trnH序列各1,736條、1,665條,均經(jīng)BLAST比對(duì)判定其準(zhǔn)確性,并納入上述數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫是基于國(guó)家自然保護(hù)區(qū)建立的首個(gè)藥用植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫,能為用戶提供長(zhǎng)白山區(qū)分布藥用植物基本信息檢索、DNA條形碼序列BLAST比對(duì)及物種鑒定等功能,對(duì)于保護(hù)長(zhǎng)白山區(qū)生物多樣性具有重要意義。與“中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)”相比,本研究收集的樣本中有38.3%的物種(264種)為新增物種,能夠豐富現(xiàn)有DNA條形碼數(shù)據(jù)庫,更好地發(fā)揮中藥材DNA條形碼分子鑒定技術(shù)對(duì)中藥材流通市場(chǎng)的監(jiān)管作用,為海關(guān)出入境檢驗(yàn)檢疫及食品藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)提供有效工具,從源頭保證臨床用藥安全。2.建立基于鳥槍法宏基因組測(cè)序的中成藥生物組分監(jiān)測(cè)方法:收集龍膽瀉肝丸處方各味藥材作為對(duì)照,經(jīng)性狀鑒別及DNA條形碼鑒定以確保對(duì)照藥材均為正品;依照《中國(guó)藥典》規(guī)定方法在實(shí)驗(yàn)室自制龍膽瀉肝丸對(duì)照樣本2份(RF01-02),RF02加入人參作為陽性對(duì)照;另購(gòu)買3份市售樣本(LDXGW01-03)。分別提取上述樣品基因組DNA,構(gòu)建PCR Free文庫,采用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行鳥槍法宏基因組測(cè)序。原始數(shù)據(jù)過濾后去除低質(zhì)量測(cè)序reads,高質(zhì)量測(cè)序reads比對(duì)ITS2、psbA-trnH和matK數(shù)據(jù)庫,成功比對(duì)的測(cè)序reads拼接后,獲得待檢中成藥樣品DNA條形碼序列;在“中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)”中對(duì)所得序列進(jìn)行BLAST比對(duì),獲得物種鑒定結(jié)果;此外,依照《中國(guó)藥典》規(guī)定方法對(duì)龍膽瀉肝丸有效成分進(jìn)行薄層色譜鑒別及含量測(cè)定。本研究共獲得100 G原始數(shù)據(jù),經(jīng)拼接過濾后得到261個(gè)對(duì)照及市售樣品ITS2,psbA-trnH和matK序列contig。分析結(jié)果顯示ITS2序列鑒定效率最高,2份對(duì)照樣本均能夠成功檢出龍膽瀉肝丸處方規(guī)定的全部物種,且RF02能夠檢出陽性對(duì)照藥材人參,證明該方法具備良好的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。市售樣品經(jīng)薄層色譜鑒別及含量測(cè)定均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定,然而宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示市售樣品采用川木通藥材(Clematidis Armandii Caulis)替代處方規(guī)定的木通藥材(Akebiae Caulis)。綜上,基于鳥槍法宏基因組測(cè)序的中成藥生物組分監(jiān)測(cè)方法,能夠精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)中成藥物種組成,是對(duì)復(fù)雜組方中成藥質(zhì)量控制方法研究的新突破。3.建立基于SMRT測(cè)序的中成藥生物組分監(jiān)測(cè)方法:購(gòu)買九味羌活丸組方各味藥材作為對(duì)照,經(jīng)性狀鑒別及DNA條形碼鑒定以確保對(duì)照藥材均為正品。依照《中國(guó)藥典》規(guī)定方法將上述中藥材粉碎并混合均勻,制成九味羌活丸對(duì)照樣本2份(RF01-02),RF02加入人參作為陽性對(duì)照;購(gòu)買3份市售樣本(JWQHW01-03)。提取上述樣品基因組DNA,擴(kuò)增其ITS2和psbA-trnH序列,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行SMRT測(cè)序及數(shù)據(jù)分析,所得序列在“中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)”中進(jìn)行物種判定。SMRT測(cè)序共獲得518.6 M數(shù)據(jù),經(jīng)過濾后獲得可用于后續(xù)分析的ITS2和psbA-trnH序列環(huán)狀一致性測(cè)序reads(CCS reads)分別為5,416條和4,342條。物種判定結(jié)果顯示2份對(duì)照樣本均能夠檢出組方中除蒼術(shù)、白芷外的七味藥材,與Sanger測(cè)序結(jié)果一致,且RF02檢出陽性對(duì)照藥材人參,顯示該方法具備良好的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。市售樣本JWQHW01-03均未檢出地黃、白芷,此外,JWQHW02還未檢出黃芩;研究還發(fā)現(xiàn),市售樣本ITS2和psbA-trnH序列CCS reads比對(duì)到27科47屬和12科18屬其他物種,如JWQHW02中檢出白術(shù)(Atractylodes macrocephala),而當(dāng)歸屬(Angelica)、前胡屬(Peucedanum)物種在市售樣本中均被檢出,顯示該方法能夠有效檢出混淆品及其他雜質(zhì)。本研究表明該方法適用于中成藥生產(chǎn)加工全流程的質(zhì)量監(jiān)控,為修訂中成藥質(zhì)量控制方法提供新思路,推進(jìn)《中國(guó)藥典》中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R284;S567
【部分圖文】：

第二章長(zhǎng)白山區(qū)藥用植物ＤＮＡ條形碼數(shù)據(jù)庫構(gòu)建??長(zhǎng)白山脈是松花江、鴨綠江和圖們江三江發(fā)源地，是歐亞大陸東緣的最高山系。??廣義的長(zhǎng)白山脈包含我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧三省東部山區(qū)，而狹義的長(zhǎng)白山則是??指長(zhǎng)白山主峰附近的山脈。長(zhǎng)白山是處于休眠期的活火山，其地貌自下而上由玄武??巖臺(tái)地、玄武巖高原和火山錐體三部分構(gòu)成，火山口由１６座奇峰環(huán)繞，形成天池??及瀑布等景觀，其中最高峰為白云峰，海拔２，６９１?ｈｌ長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū)成立于１９６０??年，位于吉林省東南部，東經(jīng)１２７°?４２＇５５＂?－?１２８°?１６＇４８＂，北緯４１°?４１＇４９”－４２°??２５’１８＂范圍內(nèi)，毗鄰朝鮮民主主義人民共和，１］。１９８０年，聯(lián)合國(guó)教科文組織（Ｕｎｉｔｅｄ??Ｎａｔｉｏｎｓ?Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ，?Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ?ａｎｄ?Ｃｕｌｔｕｒａｌ?Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，?ＵＮＥＳＣＯ）正式批準(zhǔn)其力口入??國(guó)際生物圈保護(hù)區(qū)網(wǎng)，成為世界自然保留地之一，是“人與生物圈計(jì)劃”的重要組??成部分，并于１９８６年晉升為國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，占地１９６，６１８公頃［２］，森林覆蓋率??超８０％，是典型的山地森林保護(hù)區(qū)。??

本研究采用鳥槍法宏基因組測(cè)序?qū)Γ卜蔟埬憺a肝丸對(duì)照樣本及３份市售樣本進(jìn)??行測(cè)序。其中，各樣本基因組ＤＮＡ瓊脂糖凝膠電泳及Ａｇｉｌｅｎｔ?２１００檢測(cè)結(jié)果見圖??３－１、圖３－２。自ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ?２５００測(cè)序平臺(tái)獲得大于１００Ｇ的原始數(shù)據(jù)，總計(jì)超??過７＿５億個(gè)ｒｅａｄｓ?（表３－５），序列覆蓋度及ｍａｐｐｉｎｇ結(jié)果見表３－６，經(jīng)拼接和過濾后，??獲得ＩＴＳ２、和顯汰序列ｃｏｎｔｉｇｓ共計(jì)２６１個(gè)（表３－７）。??ｄｉｇｅｓｔ?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ??＿＿ｂｐ??１＾＊１一２３１３０??＾９４１６??６５５７??４３６１??隱１１??圖３－１龍膽瀉肝丸各樣本瓊脂糖凝膠電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１．?Ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｆｉｖｅ?ＬＤＸＧＷ?ｓａｍｐｌｅｓ??１－５：?ＬＤＸＧＷ０１

Ａ?Ｂ?Ｃ?Ｄ??圖３－３市售龍膽瀉肝丸樣本中龍膽苦苷、梔子苷及甘草對(duì)照藥材薄層色譜圖??Ｆｉｇｕｒｅ?３－３．?ＴＬＣ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｇｅｎｔｉｏｐｉｃｒｉｎ，?ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ，?ａｎｄ?Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅ?Ｒａｄｉｘ??ｅｔ?Ｒｈｉｚｏｍａ??Ａ．?Ｇｅｎｔｉｏｐｉｃｒｉｎ?Ｂ．?Ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ??Ｃ．?Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｅ?Ｒａｄｉｘ?ｅｔ?Ｒｈｉｚｏｍａ，?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｓｕｎｌｉｇｈｔ??Ｄ．?Ｇｌｙｃｙｎ＊ｈｉｚａｅ?Ｒａｄｉｘ?ｅｔ?Ｒｈｉｚｏｍａ，?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ＵＶ?ｌｉｇｈｔ?（３６５?ｎｍ）??１．?ｔｅｓｔ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＬＤＸＧＷＯ?１??２．?ｔｅｓｔ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＬＤＸＧＷ０２??３．?ｔｅｓｔ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＬＤＸＧ?Ｗ０３??４．?ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｓｕｂｓｔａｎｃｅ?（ＣＲＳ）?［Ａ，?Ｂ，?ａｎｄ?Ｃ］?／?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｄｒｕｇ?（ＲＤ）?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?［Ｄ］??５．?ｔｅｓｔ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＬＤＸＧＷ０１＋ＣＲＳ?［Ａ．?Ｂ，?ａｎｄ?Ｃ］?／?ＲＤ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ?［Ｄ］??

本文編號(hào)：2842776