目的:運用體外分離和培養(yǎng)小鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的方法,研究梔子苷對脂多糖誘導的星形膠質(zhì)細胞釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)的影響,探討梔子苷對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠星形膠質(zhì)細胞中樞炎癥反應抗炎免疫的分子機制。方法:1.選取出生1-2天的新生ICR小鼠,分離小鼠大腦皮質(zhì),經(jīng)純化、傳代培養(yǎng)得到原代星形膠質(zhì)細胞,并利用形態(tài)學、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白免疫熒光鑒定細胞。2.通過形態(tài)學觀察和CCK-8實驗方法,確定LPS作用于星形膠質(zhì)細胞不同濃度、不同時間,模擬制造合格中樞炎癥環(huán)境模型。3.通過形態(tài)學觀察和CCK-8實驗方法,檢測梔子苷對星形膠質(zhì)細胞的毒性以及活性的影響,確定最佳用藥濃度及作用時間。4.利用酶聯(lián)免疫法測定梔子苷對LPS誘導的星形膠質(zhì)細胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6的影響。5.實驗結(jié)果采用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。結(jié)果:1.原代星形膠質(zhì)細胞經(jīng)培養(yǎng)、鑒定后,純度在95%以上,滿足下一步實驗要求。2.脂多糖刺激星形膠質(zhì)細胞后,細胞數(shù)量增多,胞體肥大,突起增多。3.LPS組同對照組相比,細胞上清液中IL-6、TNF-α水平顯著升高(P0.01),且隨著時間延長,呈劑量依賴型增長。4.脂多糖可增強細胞增殖活性,且在作用濃度為1μg/mL,作用時長為24h時效果最好。5.梔子苷濃度在500μmol/L、1000μmol/L、2000μmol/L時使星形膠質(zhì)細胞的活性下降,產(chǎn)生細胞毒性。6.梔子苷在0.5-100μmol/L范圍內(nèi)對星形膠質(zhì)細胞增殖活性沒有影響。7.100μmol/L以下梔子苷濃度不同孵育時間3h、6h、12h、24h、48h、72h與對照組相比沒有顯著性差異(P0.05),說明100μmol/L以下梔子苷濃度,作用時間72h以下對星形膠質(zhì)細胞的活性沒有影響,無細胞毒性。8.梔子苷組與模型組比較,1、10、100μmol/L梔子苷作用24h下均能顯著下調(diào)TNF-α、IL-6炎癥因子水平(P0.01),尤以IL-6下降明顯。9.100μmol/L梔子苷濃度作用24h下抑制IL-6和TNF-α分泌更為顯著。結(jié)論:1.脂多糖(1μg/ml,24h)可明顯增強細胞增殖活性,并增加炎癥因子的釋放。2.梔子苷能抑制星形膠質(zhì)細胞的活性以及降低炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放。
【學位單位】：長春中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

DAPI GFAP Merge圖 11 原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)與純度。圖片為細胞片GFAP免疫熒光染色的結(jié)果，圖片中綠色代表的是GFAP陽性細胞，即星形膠質(zhì)細胞；藍色為DAPI與細胞核結(jié)合所呈顏色，代表所有細胞片上的所有細胞核，星形膠質(zhì)細胞純度=星形膠質(zhì)細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。N=3;Scalebar=100μm表 1 星形膠質(zhì)細胞純度組別星形膠質(zhì)細胞數(shù)(個)細胞總數(shù)（個） 細胞純度（%）1 267 275 97.10 %2 185 193 95.85%3 158 160 98.75%4 102 103 99.02%5 201 210 95.71%

不同濃度 LPS 對星形膠質(zhì)細胞增殖的影響（0.125μg/mL 濃度作用星形膠質(zhì)較沒有顯著性差異（p>0.05），對星形膠質(zhì)細胞增殖沒有影響；0.25、0.5 、L LPS 作用星形膠質(zhì)細胞 24h 后與對照組相比具顯著性差異（p＜0.01），影響。）度LPS對星形膠質(zhì)細胞分泌IL-6、TNF-α的影響刺激時 IL-6、TNF-α分泌很低，同對照組相比，不同濃度 LPS 作h 后，細胞上清液中 IL-6、TNF-α水平顯著升高(P＜0.01)。1μg/mL最為效果明顯。結(jié)果見表 3，圖 13。表 3 不同濃度 LPS 對星形膠質(zhì)細胞分泌 IL-6、TNF-α的影響(pg/mL, x±濃度（μg/L） IL-6（pg/mL） TNF-α（pg/mL）0 48.24±3.40 356.78±9.57

圖 13 不同濃度 LPS 對星形膠質(zhì)細胞分泌 TNF-α、IL-6 的影響間 LPS 作用對星形膠質(zhì)細胞活性的影響 LPS 分別作用星形膠質(zhì)細胞 3、6、12、24、48h 后活性分別為（116±％、（123±4）％、（145±3）％、（158±9）％，與對照組相比，>0.05）；6h 組有差異（p<0.05）；12、24、48h 組有顯著性差異（P細胞活性呈增長趨勢，但在 48h 組中細胞密度大于 90%，接下來細長，不利于實驗結(jié)果的準確，因此后續(xù)實驗造模過程中選用 24h 時見圖 14，表 4。表 4 不同時間 LPS 作用對星形膠質(zhì)細胞活性的影響 (%, x±s)時間(h) 細胞存活率0 100±1
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本文編號：2841747