[目的]:基于DNA條形碼技術(shù)及高分辨率熔解曲線技術(shù)分別對復(fù)方半邊蓮注射液中藥材原材料白花蛇舌草和半邊蓮及這兩種藥材常見偽品做分子檢測鑒定,同時研究該復(fù)方對阿霉素腎病大鼠相關(guān)藥效學(xué)作用。[方法]:通過提取白花蛇舌草及其常見混偽品基原植物DNA,獲取ITS2序列片段并結(jié)合GenBank相關(guān)下載序列,經(jīng)CodonCode Aligner軟件拼接,利用MEGA軟件進行變異位點分析,遺傳距離計算和構(gòu)建鄰接(NJ)系統(tǒng)發(fā)育聚類樹。同時隨機檢測37份市售藥材白花蛇舌草,經(jīng)中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)進行序列比對并構(gòu)建鄰接(NJ)系統(tǒng)發(fā)育聚類樹確定物種,鑒別真?zhèn)�。通過Rotor-Gene Q實時定量PCR儀,基于ITS2序列對半邊蓮及其常見混偽品及近緣屬基原植物進行高分辨率熔解曲線分析,同時對40份市售半邊蓮藥材進行鑒定,通過查看熔解曲線是否與基原植物重合方式鑒定物種,不重合物種將PCR產(chǎn)物測序后進行序列比對鑒定物種。尾靜脈一次性注射阿霉素構(gòu)造SD大鼠腎病模型,將48只雄性大鼠分為空白組、模型組、陽性藥組和復(fù)方半邊蓮注射液低、中、高劑量組。進行尿液,血清,及腎臟組織的采集,做病理HE染色及TNF-α和IL-6兩個細胞因子免疫組化,對相關(guān)指標(biāo)進行分析。[結(jié)果]:白花蛇舌草基原植物ITS2序列種內(nèi)K2P最大遺傳距離遠小于其與混偽品種間K2P最小遺傳距離,NJ樹結(jié)果表明白花蛇舌草基原植物可與其混偽品明顯區(qū)分;市售藥材中正品29份,偽品8份,其中半枝蓮和遠志為新發(fā)現(xiàn)的偽品。半邊蓮與其6種常見混偽品并且與自身3種不同單倍型熔解曲線有明顯差異,對市售半邊蓮40份樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)25份屬于半邊蓮單倍型A,5份屬于半邊蓮單倍型B,5份屬于半邊蓮單倍型C,2份為半枝蓮,另有3份樣品沒有與已知的基原植物曲線重合,PCR產(chǎn)物測序后比對發(fā)現(xiàn)三個新偽品分別是馬唐,黃花蒿。藥效研究表明,高劑量組能顯著降低尿液中尿蛋白含量,血液中血肌酐、尿素氮、總膽固醇、甘油三酯、總蛋白、血清蛋白與模型組相比均有明顯改善,低中劑量組相對效果不顯著。HE染色結(jié)果表明中高劑量組起到緩解腎硬化及損傷的作用,組化結(jié)果表明,IL-6及TNF-α因劑量加大而呈現(xiàn)表達減弱的趨勢。[結(jié)論]:應(yīng)用DNA條形碼和HRM技術(shù)可以對中藥原藥材白花蛇舌草和半邊蓮進行快速準(zhǔn)確分子鑒定,也為其他中藥材原材料鑒定提供了參考與規(guī)范,從源頭上解決了中藥制劑原材料發(fā)生混偽,誤用現(xiàn)象的發(fā)生,保證了用藥安全。同時,該復(fù)方注射液對有病理學(xué)改變的阿霉素腎病大鼠,在適宜藥物劑量時,具有明確的治療效果,為后續(xù)其在臨床應(yīng)用研究提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R285.5;R282.5
【部分圖文】：

整至適當(dāng)焦距，獲得清晰圖像，做好記錄。??３．?６?ＰＣＲ測序??參照Ｍａｒｋｅｒ上條帶位置（圖２－１），樣品應(yīng)在相應(yīng)ＤＮＡ條形碼序列??長度位置上出現(xiàn)一條明亮單一的條帶，若條帶不明顯或者不清晰，可以通??過增加ＤＮＡ模板濃度后再次擴增。ＰＣＲ產(chǎn)物直接送到測序公司，應(yīng)用??Ｓａｎｇｅｒ?測序法原理，使用?ＡＢＩ?３７３０ＸＬ?型測序儀（Ａｐｐｌｉｅｄ?Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ?Ｃｏ．，??ＵＳＡ）進行雙向測序。??１９??

品的系統(tǒng)聚類樹。從所構(gòu)建的ＮＪ樹中可以看出，白花蛇舌草序列單獨聚為??一支，混偽品物種也能單獨聚為一支，呈現(xiàn)良好的單系性且自展支持率都??大于９５％?（圖２－２）。??、＼?＼！?Ｈ?／?／?／、??％，?＼?＼?＼?＼?＼?１１１?／?／?／?／??＆?、＼＿＼?＼＼?＼?１１?ｆ?ｆ?／?／?／?／?ｙ??７：￥＾歡?ｚ＼??———ｑ?ｆ?＾?二？—一?Ｌ??｜?—＊?——＊?一士?Ｉ?（?Ｉ?＂卜－＿?一－一ｃｏ—歷?ｇ??ｍ??＾ｙｙ／／／?ｎ?ｉ?＼＼＼＼＼＼ｘ??圖２－２基于ＩＴＳ２序列構(gòu)建Ｏ／Ｊｅｎ／ａＷｋ?及其混偽品鄰接（ＮＪ?）樹??注：Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ?１０００次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率之５０％??２４??

遠志（／３〇７７＜§￣３７３?２＾皿／／〇＂３）１份。偽品占抽樣調(diào)查的２１．６％。根??據(jù)以上序列的比對結(jié)果，將３７份市場藥材（包括新偽品）和前文白花蛇舌??草及其混偽品基原物種的ＩＴＳ２序列一起構(gòu)建ＮＪ樹（圖２－３）。結(jié)果可以??看出，２９份藥材與白花蛇舌草基原聚成一枝，４份與傘房花耳草聚成１枝，??１份與鵝不食草構(gòu)成一枝，２種新偽品也能單獨的聚成一枝，物種鑒定結(jié)果??與中藥材ＤＮＡ條形碼鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果相同，表明基于ＩＴＳ２?ＤＮＡ條形碼技??術(shù)能很好的鑒定藥材白花蛇舌草。??１?Ｍ?＼??Ｗ?Ｉ?？ＶＣ０＿ＴＷ?一一Ｉ?＼?Ｌ＿＂?麗薄??＾?Ｉ?一一二ｉ?＼?卜－：ｓ：：ｒ：：ｖｃｏ一層邱??圖２－３基于ＩＴＳ２序列構(gòu)建的市場藥材０／＾／ｅ？／ａ／７ｄ＾ａ?ｃｏｒ＿ｙｍ６ｏｓａ和??己知基原物種的鄰接（ＮＪ）樹??注：Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ?１０００次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率彡５０％??５．１檢索方法舉例??中藥材ＤＮＡ條形碼鑒定系統(tǒng)分為植物類和動物類藥材鑒定。其中植??物類藥材可以通過ＩＴＳ２或ｐｓｂＡ－ｔｒｎＨ序列進行物種鑒定。??Ｆａｓｔａ格式為生物信息學(xué)中表示序列基本格式，序列中Ｒ，?Ｙ，?Ｍ，Ｋ，??２６??
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本文編號：2841440