氧是人體所必需的。組織供氧減少或不能充分利用氧,導(dǎo)致組織代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常變化的病理過程稱為缺氧。正常成人靜息時的耗氧量約為250 ml/min,劇烈運動時可增加8-9倍,而人體內(nèi)儲存氧量僅為1500 ml,一旦呼吸心跳停止,數(shù)分鐘內(nèi)就可能死于缺氧。缺氧是處在高原、航空、潛水等特殊環(huán)境下最普遍的應(yīng)激因素,也是慢性阻塞性肺病、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、心肌梗死、缺血性腦卒中、失血性休克、氰化物中毒等多種疾病常見的病理過程,可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生,影響機體的各種代謝,尤其會影響機體的氧化供能,長期或嚴(yán)重缺氧可導(dǎo)致機體心、腦等重要器官能量供應(yīng)不足而死亡。疲勞,又稱疲乏,是一種主觀不適感。客觀上在同等條件下,失去其完成原來所從事的正�；顒踊蚬ぷ髂芰�,且疾病發(fā)展到一定階段都可出現(xiàn)疲勞。疲勞是現(xiàn)代社會快節(jié)奏的生活方式下的常見病理生理狀態(tài),屬于亞健康范疇。疲勞會降低工作效率,使機體早衰,導(dǎo)致各種疾病,甚至出現(xiàn)過勞死等嚴(yán)重后果。黃芪茯苓原方是軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所(原名為:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所)于20世紀(jì)70年代研制的中藥復(fù)方,根據(jù)研究所內(nèi)部資料得知,黃芪茯苓原方在駐高原部隊藏區(qū)軍隊里使用較多,是軍隊內(nèi)部使用的藥物,長期駐扎在藏區(qū)的軍人服用黃芪茯苓原方后高原病的癥狀減輕或消失,其防治高原病的效果較好,由黃芪、黨參、丹參、熟地、白芍、白術(shù)、沙參、當(dāng)歸、茯苓、首烏藤、陳皮、金果欖等12味中藥組成。新黃芪茯苓復(fù)方是在黃芪茯苓原方的基礎(chǔ)上刪減而得。本文通過小鼠常壓密閉缺氧實驗和小鼠負(fù)重游泳實驗,驗證新黃芪茯苓復(fù)方的抗缺氧和抗疲勞作用,并以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為主要研究手段,從分子水平探討新黃芪茯苓復(fù)方的抗缺氧作用機制,為其后續(xù)抗高原缺氧的開發(fā)利用提供良好的實驗依據(jù)。目的:1.根據(jù)方劑配伍中藥物的君臣佐使的基本原則,選取黃芪茯苓原方中的藥物組成新的小方組,以達到用較少的藥物組成達到相同或更好的防治效果;2.對新黃芪茯苓復(fù)方進行藥效學(xué)實驗,明確新黃芪茯苓復(fù)方的耐缺氧和抗疲勞作用,為進一步研究新黃芪茯苓復(fù)方的應(yīng)用和開發(fā)提供理論依據(jù);3.采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對小鼠心臟組織蛋白表達進行研究,并對實驗結(jié)果進行生物信息學(xué)分析,尋找新黃芪茯苓復(fù)方抗缺氧作用的相關(guān)蛋白,初步探索新黃芪茯苓復(fù)方抗缺氧的分子作用機制。方法:1.藥物篩選利用中醫(yī)傳承輔助平臺軟件,分析《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)——中藥成方制劑》中含黃芪的中藥復(fù)方的組方規(guī)律,從原方12味中藥內(nèi)篩選出合適的藥物組成新的簡方——新黃芪茯苓復(fù)方。2.小鼠常壓缺氧實驗通過建立小鼠常壓缺氧模型,以0.5%的羧甲基纖維素鈉為空白對照,黃芪茯苓原方為陽性對照,觀察不同劑量的新黃芪茯苓復(fù)方對小鼠體重和常壓缺氧存活時間的影響。檢測小鼠血清中的T-AOC、CAT、T-SOD、GSH-PX活力和MDA含量,心肌和腦組織中Na~+K~+-ATP酶、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶,并采用BCA蛋白定量法測定各組織的蛋白濃度。3.小鼠負(fù)重游泳實驗通過小鼠負(fù)重游泳實驗,以0.5%的羧甲基纖維素鈉為空白對照,黃芪茯苓原方為陽性對照,觀察不同劑量的新黃芪茯苓復(fù)方對小鼠負(fù)重游泳時間的影響。檢測小鼠肝糖原、肌糖原和小鼠血清中的LA含量、LDH活力、BUN含量。4.TMT相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)生物信息學(xué)分析小鼠心臟差異表達蛋白質(zhì)研究:以常壓缺氧實驗空白對照組和新黃芪茯苓復(fù)方高劑量組小鼠心臟組織為研究對象,對其進行蛋白質(zhì)提取、肽段酶解、TMT標(biāo)記、色譜分級,通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)數(shù)據(jù)采集對蛋白質(zhì)進行鑒定和定量分析,篩選差異表達蛋白質(zhì),并對差異表達蛋白質(zhì)進行聚類分析、功能注釋和通路分析等。結(jié)果:1.藥物篩選從黃芪茯苓原方12味中藥內(nèi)選取黃芪、茯苓、黨參、當(dāng)歸、首烏藤、丹參6味中藥組合成新的復(fù)方——新黃芪茯苓復(fù)方。2.小鼠常壓缺氧實驗新黃芪茯苓復(fù)方對小鼠體重的影響:實驗中期和實驗結(jié)束時黃芪茯苓原方和新黃芪茯苓復(fù)方各劑量組小鼠平均體重與空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),表明新黃芪茯苓對小鼠體重?zé)o不良影響。新黃芪茯苓復(fù)方對小鼠常壓耐缺氧存活時間的影響:與空白對照組比較,黃芪茯苓原方組、新黃芪茯苓復(fù)方低、中、高劑量組小鼠缺氧存活時間明顯延長(P0.05),新黃芪茯苓復(fù)方高劑量組與黃芪茯苓原方組之間無顯著性差異,表明新黃芪茯苓復(fù)方可延長小鼠常壓密閉缺氧存活時間,具有抗缺氧作用。新黃芪茯苓復(fù)方對小鼠血清中氧化抗氧化指標(biāo)的影響:與空白對照組比較,黃芪茯苓原方組、新黃芪茯苓復(fù)方高劑量組小鼠血清中T-AOC提高(P0.05),黃芪茯苓原方組、新黃芪茯苓復(fù)方各劑量組小鼠血清中CAT活力增強(P0.05),黃芪茯苓原方組、新黃芪茯苓復(fù)方中、高劑量組小鼠血清中SOD活力提高(P0.05),新黃芪茯苓復(fù)方各劑量組的小鼠血清中GSH活力增強(P0.05),黃芪茯苓原方組、新黃芪茯苓復(fù)方中、高劑量組小鼠血清中MDA含量降低(P0.05)。新黃芪茯苓復(fù)方對小鼠心肌組織和腦組織能量代謝的影響:(1)對心肌組織的影響:與空白對照組比較,黃芪茯苓原方組和新黃芪茯苓復(fù)方高劑量組的Na~+K~+-ATP酶活力提高(P0.05),黃芪茯苓原方組和新黃芪茯苓復(fù)方高劑量組的Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶活力提高(P0.05);(2)對腦組織的影響:與空白對照組比較,新黃芪茯苓復(fù)方高劑量組的Na~+K~+-ATP酶活力提高(P0.05),黃芪茯苓原方組、新黃芪茯苓復(fù)方低、中、高劑量組的Ca~(2+)Mg~(2+)-ATP酶活力提高(P0.05)。3.小鼠負(fù)重游泳實驗新黃芪茯苓復(fù)方對小鼠負(fù)重游泳時間的影響:與空白對照組比較,黃芪茯苓原方組、新黃芪茯苓復(fù)方低、中、高劑量組小鼠的負(fù)重游泳時間均顯著提高(P0.01)。新黃芪茯苓復(fù)方對小鼠肝糖原和肌糖原的影響:與空白對照組比較,黃芪茯苓原方組、新黃芪茯苓復(fù)方中、高劑量組小鼠的肝糖原儲存量顯著增高(P0.01),新黃芪茯苓復(fù)方低、中、高劑量組小鼠肌糖原的儲存量均明顯提高(P0.05)。新黃芪茯苓復(fù)方對小鼠血清中各指標(biāo)的的影響:(1)與空白對照組比較,黃芪茯苓原方組、新黃芪茯苓復(fù)方中劑量組小鼠血清中LA含量明顯降低(P0.05),新黃芪茯苓復(fù)方高劑量組小鼠血清中LA含量顯著降低(P0.01),且與黃芪茯苓原方組比較仍明顯降低(P0.05),說明新黃芪茯苓復(fù)方可降低小鼠血清中的LA含量。(2)與空白對照組比較,黃芪茯苓原方組和新黃芪茯苓復(fù)方低劑量組小鼠血清中的LDH活力明顯升高(P0.05),新黃芪茯苓復(fù)方中、高劑量組小鼠血清中的LDH活力顯著升高(P0.01),且與黃芪茯苓原方組相比,新黃芪茯苓復(fù)方高劑量組仍明顯升高(P0.05),提示新黃芪茯苓復(fù)方可升高小鼠血清中的LDH的活力。(3)與空白對照組比較,黃芪茯苓原方組小鼠血清中的BUN含量明顯降低(P0.05),新黃芪茯苓復(fù)方低、中、高劑量組小鼠血清中BUN含量顯著降低(P0.01),且與黃芪茯苓原方組相比,新黃芪茯苓復(fù)方低劑量組小鼠血清中的BUN含量仍顯著降低(P0.01),提示新黃芪茯苓復(fù)方可降低小鼠血清中的BUN含量。4.TMT相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)生物信息學(xué)分析本實驗鑒定的二級質(zhì)譜譜圖總數(shù)為339,987張,其中肽段匹配的譜圖數(shù)為77,963張,鑒定到的肽段總數(shù)是27,558個,唯一肽段總數(shù)是24,749個,鑒定到小鼠心臟中的蛋白質(zhì)為3790個;其中,上調(diào)的差異表達蛋白質(zhì)有10個,下調(diào)的差異表達蛋白質(zhì)27個。差異表達蛋白質(zhì)GO功能富集分析得GO功能注釋共330條,包括亞鐵血紅素的eIF2α磷酸化的調(diào)節(jié)、翻譯起始的eIF2α磷酸化的調(diào)節(jié)等268條重要生物過程,氧轉(zhuǎn)運體活性、氧結(jié)合等52條分子功能,和血紅蛋白復(fù)合物、胞漿部分等10條細(xì)胞組成。這些差異表達蛋白質(zhì)的功能主要是結(jié)合、蛋白結(jié)合、陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、離子結(jié)合,這些差異表達蛋白質(zhì)主要參與了單細(xì)胞過程、細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、生物過程調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)等重要生物學(xué)過程。差異表達蛋白質(zhì)KEGG通路富集分析得知,上調(diào)差異表達蛋白質(zhì)主要參與非洲錐蟲病通路、瘧疾通路、自身免疫性甲狀腺疾病通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用通路、其他類型的O-聚糖的生物合成通路、人乳頭瘤病毒感染通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等7條通路;下調(diào)差異表達蛋白主要參與非洲錐蟲病通路、瘧疾通路、自身免疫性甲狀腺疾病通路、IL-17信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用通路、移植物抗宿主病、人乳頭瘤病毒感染通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等8條通路。構(gòu)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),分析可知,共有4個上調(diào)與16個下調(diào)差異表達蛋白質(zhì)存在直接或間接相互作用關(guān)系,其中,Gapdh、Hbb-b2、Arhgef6、H2-K1、Ighm、Cav3、Arhgdib、S100a8、S100a9等基因在網(wǎng)絡(luò)中較活躍,對應(yīng)的3-磷酸甘油醛脫氫酶、β珠蛋白、Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子6、MHC H-2K抗原、免疫球蛋白鏈C區(qū)、微囊蛋白-3、Rho GDP解離抑制劑2、s100-a8蛋白、s100-a9蛋白在網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白的相互作用較密切,提示在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中具有重要的作用。結(jié)論:1.新黃芪茯苓復(fù)方可延長小鼠常壓密閉缺氧存活時間,具有抗缺氧作用;能清除過量的氧自由基,減少自由基對機體的損傷,具有抗脂質(zhì)過氧化的作用,能夠減輕細(xì)胞能量代謝,對脂質(zhì)過氧化引起的細(xì)胞膜損傷有保護作用,對缺氧誘發(fā)的氧化損傷具有良好的改善作用;能改善常壓缺氧小鼠心肌和腦組織能量代謝,對抗缺氧造成的心肌和腦組織損傷。2.新黃芪茯苓復(fù)方可延長小鼠負(fù)重游泳時間,具有抗疲勞作用;能通過提高小鼠的肝糖原、肌糖原的儲存量,降低小鼠血清中的LA含量和BUN含量,升高小鼠血清中的LDH的活力,減輕肌肉損傷,增強小鼠的抗疲勞能力。3.新黃芪茯苓復(fù)方抗缺氧作用可能與β珠蛋白、s100-a8蛋白、s100-a9蛋白等下調(diào)差異表達蛋白關(guān)系最為密切,與IL-17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等通路有關(guān),其確切機制還需進一步驗證。
【學(xué)位單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖0-1本文研究思路Figure0-1Researchideas

含黃芪常用藥物組合網(wǎng)絡(luò)

A B C注：A 支持度為 25%；B 支持度為 30%；C 支持度為 35%；A、B、C 置信度均為 0.9圖 1-2 含“黃芪-當(dāng)歸”處方常用藥物組合網(wǎng)絡(luò)
【參考文獻】

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本文編號：2841284