近年來,由于人口老齡化、不良生活習(xí)慣、環(huán)境污染和傳統(tǒng)手段治愈率較低等因素,癌癥己成為威脅我們生命健康的重要疾病。然而,很多癌癥都缺乏有效的藥物治療。隨著分子細胞生物學(xué)的發(fā)展,分子靶向治療越來越受到研究人員和臨床醫(yī)生的重視,是一種被廣泛研究的有效的癌癥治療方式。臨床上已有成功的藥物用于個別癌癥的治療,有效延長病人的存活。在癌癥的發(fā)生與發(fā)展中,激酶和磷酸酶扮演者重要的角色。由激酶和磷酸酶介導(dǎo)的蛋白的磷酸化和去磷酸化是基本的細胞信號傳導(dǎo)調(diào)控方式,通過可逆的磷酸化調(diào)控著很多細胞功能,可逆磷酸化的異常會誘發(fā)多種疾病產(chǎn)生,如炎癥、腫瘤。Shp2是PTPN11基因編碼的胞內(nèi)非受體蛋白酪氨酸磷酸酶,是PTPs家族中的一員,它廣泛表達于胚胎和各種成人組織中,參與多種信號通路的調(diào)控,如:Ras/Erk、PI3K/Akt、Jak/Stat,從而調(diào)控細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等。先前研究證明,Shp2是一個能誘導(dǎo)癌癥發(fā)生的原癌基因,在白血病、乳腺癌、胃癌、非小細胞肺癌等疾病中,都發(fā)現(xiàn)Shp2具有促進作用,Shp2功能獲得性突變將引起努南綜合征(NS)、豹斑綜合征(LS)、青少年粒單核細胞白血病(JMML),而動物實驗證明,敲除Shp2基因或抑制Shp2的高活性可以阻滯或延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此,Shp2是一個很好的藥物開發(fā)靶點,開發(fā)Shp2的抑制劑具有重大的現(xiàn)實意義。為了發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2的抑制劑,我們通過利用大腸桿菌系統(tǒng)原核表達出了 Shp2活性催化區(qū)(PTP-Shp2蛋白)以及Shp2同家族蛋白Shpl蛋白、VHR蛋白、HePTP蛋白,這些同家族蛋白作為檢測我們篩選到的抑制劑是否只特異的抑制PTP-Shp2的參照蛋白。隨后我們建立起了基于pNPP(一種蛋白酪氨酸磷酸酶的通用底物)的酶和底物反應(yīng)的體外高通量篩選模型。首先,利用該篩選模型,從太子參、筋骨草、金線蓮、紅菇4種中藥的共223種內(nèi)生菌活性成分中,我們篩選發(fā)現(xiàn)筋骨草內(nèi)生菌的一個活性成分(命名為g28)是PTP-Shp2的特異性抑制劑;從魚腥草等30種中藥粗的餾分中,我們篩選發(fā)現(xiàn)魚腥草、蒲公英、腫節(jié)風(fēng)、夏枯草這4種中藥粗餾分特異性抑制PTP-Shp2的活性。接下來從329種中藥天然單體中我們篩選發(fā)現(xiàn)H320(異阿魏酸)和H335(肉桂酸)對PTP-Shp2具有特異的強抑制作用。在細胞水平實驗中,通過實驗驗證,在293T細胞中,H320能夠抑制EGF誘導(dǎo)下Shp2依賴的MAPK的活化;先前的研究發(fā)現(xiàn)MDA-MB-468細胞的增殖和遷移依賴Shp2,我們用H335處理MDA-MB-468細胞系及Shp2 Q79P穩(wěn)轉(zhuǎn)MDA-MB-468細胞系后,發(fā)現(xiàn)H335能夠抑制EGF誘導(dǎo)下Shp2依賴的MAPK的活化,并且能夠抑制MDA-MB-468細胞的遷移。因此,我們首次從中藥天然單體中發(fā)現(xiàn)兩種Shp2的特異性抑制劑H320(異阿魏酸)和H335(肉桂酸),通過后續(xù)的相關(guān)細胞功能研究及結(jié)構(gòu)改造,有望開發(fā)成治療與Shp2相關(guān)的癌癥的藥物。
【學(xué)位單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284
【部分圖文】：

—１—??前目??一旦該位點被磷酸化后，則能招募Ｇｒｂ２／Ｓｏｓ復(fù)合體至細胞膜，進而使Ｒａｓ／ＭＡＰＫ??通路被激活［７８，７９］。另外，也有研宄證明在應(yīng)答ＥＧＦ信號中，ＳｈＰ２的第５８０位酪??氨酸也能與Ｇｒｂ２結(jié)合，進而活化Ｒａｓ＾ｌ通過這些研究說明Ｓｈｐ２在一些情況下??能夠作為一個接頭蛋白發(fā)揮作用，而不涉及其ＰＴＰ酶的活性。??Ｍｏｄｅｌ?ａ?Ｍｏｄｅｌ?ｂ?Ｍｏｄｅｌ?ｃ??Ｇｒｏｗｔｈ?ｆａｃｔｏｒ?Ｇｒｏｗｔｈ?ｆａｃｔｏｒ??

．會ｐｒ〇Ｕｔｙ?ＭＡＰＫ??圖１－２?Ｓｈｐ２參與調(diào)控Ｒａｓ／ＭＡＰＫ的三種模型示意圖。??Ｆｉｇ．１－２?Ｔｈｒｅｅ?ｍｏｄｅｌｓ?ｐｒｏｐｏｓｅｄ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｒａｓ／ＭＡＰＫ?ｂｙ?Ｓｈｐ２．??摘自：Ｍａｔｏｚａｋｉ?Ｔ，?Ｍｕｒａｔａ?Ｙ，Ｓａｉｔｏ?Ｙ，ｅｔ?ａｌ．?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｔｙｒｏｓｉｎｅ?ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ?ＳＨＰ－２：?ａ??ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｔｈａｔ?ｐｒｏｍｏｔｅｓ?Ｒａｓ?ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．?Ｃａｎｃｅｒ?Ｓｃｉ，?２００９，１００（１０）：?１７８６－??９３．??１．２．３．２?Ｓｈｐ２對ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信號通路的調(diào)控??ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ是一條重要的信號通路，可以調(diào)節(jié)生長因子、細胞因子或激素刺激??下的重要的生物學(xué)和病理生理學(xué)活動［８１］。在不同的細胞生理條件下，Ｓｈｐ２在??ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ中發(fā)揮雙重作用，既可以發(fā)揮正向調(diào)控作用也可以發(fā)揮負向調(diào)控作用。??類似于Ｓｈｐ２在Ｒａｓ／ＭＡＰＫ途徑，Ｓｈｐ２也促進生長因子依賴的ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信??號傳導(dǎo)［８２］。Ｋｗｏｎ等發(fā)現(xiàn)在平滑肌細胞中，Ｓｈｐ２與ＰＩ３Ｋ的ｐ８５亞基結(jié)合，導(dǎo)致??胰島素樣生長因子－１?（ＩＧＦ－１）刺激下的ＰＩ３Ｋ的活化

重懸后進行超聲破碎及ＧＳＴ－４Ｂ純化，然后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳驗證提純效果。??ＰＴＰ－Ｓｈｐ２、Ｓｈｐｌ、ＶＨＲ、ＨｅＰＴＰ蛋白經(jīng)１０％的聚丙烯酰胺凝膠電泳后進行考馬??斯亮藍染色，從圖３－１八中可以看出，？丁？４１＾２蛋白與０８丁－４８孵育４小時后，??大部分破碎菌液中的ＰＴＰ－Ｓｈｐ２蛋白均被吸附，隨后經(jīng)過Ｂｕｆｆｅｒ?Ｅ洗脫下來的??ＰＴＰ－Ｓｈｐ２蛋白，分子量大小約為７０ｋＤ，大小符合預(yù)期，純度符合體外高通量篩??選要求。同樣的，從圖３－１?Ｂ中可以看出原核表達純化的Ｓｈｐｌ、ＶＨＲ、ＨｅＰＴＰ蛋??白的大小分別約為９４?ｋＤｒ?４５?ｋＤ、６４?ｋＤ，大小符合預(yù)期。因此，分離純化的蛋??白均可以達到體外高通量篩選要求。??Ａ?Ｂ??Ｍａｒｋｅｒ?ＰＴＦ－Ｓｈｐ２?ＰＴＰ－Ｓｈｐ２?ＧＳＴ４Ｂ?吸附后上潘?Ｍａｒｋｅｒ?ＰＴＰ－Ｓｈｐ２?Ｓｈｐ１?ＶＨＲ?ＨｅＰＴＰ??ｉｒｏｋｏｒ＾ＭＷ＾??１７０ｋＤ?１３０ｋ〇ｊ＾Ｐ＜．＞??１３０ｋＤ??７０ＫＤ?７°ｋＤＭＰ＿Ｐ＾??５５ｋＤ?Ｓ５ｋＤ＾Ｗ；；??４〇ｋｄ?４〇ｋＤｐｐ＇??３５ｋＤ?ｆ?３５ｋＤ＿｜｜??２５ｋＤ?｜?＾?２５ｋＤ？：??圖３－１考馬斯亮藍染色驗證ＰＴＰ－Ｓｈｐ２、Ｓｈｐｌ、ＶＨＲ、ＨｅＰＴＰ的純化結(jié)果。??Ａ．體外分離純化的ＰＴＰ－Ｓｈｐ２蛋白經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳后考馬斯染色結(jié)果。ＰＴＰ－??Ｓｈｐ２大小約為７０?ｋＤ
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;The SHP-2 tyrosine phosphatase: Signaling mechanisms and biological functions[J];Cell Research;2000年04期

本文編號：2841210