目的:探討槲皮素與鐵處理對慢加急性酒精攝入誘導(dǎo)的肝鐵過載及鐵噬紊亂的影響,進(jìn)而闡明鐵噬在酒精性肝鐵過載中的作用及槲皮素的拮抗機(jī)制。方法:1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):90只18-20 g成年雄性C57BL/6J小鼠按體重隨機(jī)分為以下9組:1)正常對照組(C):正常Lieber De Carli液體飼料;2)慢加急酒精模型組(E):乙醇供能28%的Lieber De Carli1液體飼料;3)槲皮素對照組(Q):正常Lieber De Carli液體飼料,灌胃槲皮素100mg/kg.B.W.;4)槲皮素+酒精組(E+Q):槲皮素100 mg/kg.B.W.+乙醇供能28%的Lieber De Carli液體飼料;5)高鐵對照組(HI):含羰基鐵0.2%的正常Lieber De Carli液體飼料;6)高鐵+酒精組(HI+E);7)槲皮素+高鐵+酒精組(HI+E+Q);8)低鐵對照組(LI):去除飼料中鐵的正常Lieber De Carli液體飼料;9)低鐵+酒精組(LI+E)。各組小鼠等能量配對喂養(yǎng),采用慢加急酒精喂養(yǎng)方式建立酒精性肝損傷模型,期間定期記錄小鼠體重和攝食量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采血測定甘油三酯、轉(zhuǎn)氨酶水平;HE和油紅染色及酶法觀察肝組織病理學(xué)改變和脂肪變性;普魯士藍(lán)染色觀察肝臟鐵沉積,火焰原子吸收分光光度法檢測肝臟總鐵和可變鐵池(liable iron pool,LIP)水平;western blot分析自噬與鐵噬相關(guān)蛋白表達(dá),免疫熒光雙標(biāo)觀察肝臟鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain,FTH)和核受體輔激活蛋白4(nuclear receptor coactivator4,NCOA4)的共定位;軟件預(yù)測分析得出CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT enhancer bingding proteinβ,CEBPβ)和叉頭框蛋白1(Forkhead box protein O1,FOXO1)可能是NCOA4的轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí)提取肝組織核蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,免疫組化觀察FOXO1的核定位。2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):利用腺病毒轉(zhuǎn)染NCOA4(Ad-NCOA4)或空載體(Ad-Null)的HepG2細(xì)胞,經(jīng)酒精(100 mmol/L)或槲皮素(100μmol/L)處理72h后,western blot檢測細(xì)胞自噬、鐵噬水平相關(guān)及鐵蛋白輕鏈(ferritin light chain,FTL)蛋白的表達(dá),普魯士藍(lán)染色觀察細(xì)胞鐵沉積,比色法檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。在此基礎(chǔ)上,對HepG2細(xì)胞在酒精(100 mmol/L)或槲皮素(100μmol/L)處理的同時(shí),加入FOXO1轉(zhuǎn)錄活性抑制劑(AS,1μmol/L),72h后熒光探針法檢測溶酶體pH變化,CCK-8法檢測細(xì)胞活力,western blot檢測沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(Sirtuin1,SIRT1)、p-FOXO1、轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)、FTL及鐵噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.等能量配對喂養(yǎng)12周后,所有酒精暴露組小鼠體重明顯輕于非酒精喂養(yǎng)組,槲皮素干預(yù)后體重稍有回升但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;慢加急性酒精喂養(yǎng)、高鐵處理,尤其是兩者聯(lián)合暴露后小鼠肝體比明顯升高,經(jīng)槲皮素干預(yù)后與相應(yīng)對照組相比肝體比明顯回落。2.與正常對照相比,慢加急性酒精喂養(yǎng)后小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積增加,血清和肝組織TG水平以及血清ALT和AST水平分別升高了73.5%(P0.01)、24.5%(P0.01)、116%(P0.01)和162%(P0.01);酒精喂養(yǎng)小鼠同時(shí)給予0.2%羰基鐵后,上述變化進(jìn)一步加重,但給予低鐵處理則有一定程度緩解;對酒精喂養(yǎng)小鼠和酒精聯(lián)合高鐵喂養(yǎng)小鼠予以槲皮素干預(yù),與相應(yīng)的單純模型組和共同喂養(yǎng)組相比,肝脂質(zhì)蓄積及血清和肝組織TG水平明顯降低,血清ALT和AST水平減少。3.與正常小鼠相比,慢加急性酒精攝入后,肝臟總鐵、LIP水平和FTL表達(dá)分別升高了46.7%(P0.01)、45.7%(P0.01)和1.98倍(P0.01),肝臟LC3II、NCOA4蛋白表達(dá)分別減少了72.8%(P0.05)、71.2%(P0.05),p62、FTH蛋白水平分別增高了9.69倍(P0.01)、3.09倍(P0.01),肝臟FTH和NCOA4熒光共定位區(qū)域減少;與酒精組相比,酒精聯(lián)合高鐵共同喂養(yǎng)后,上述變化進(jìn)一步惡化,但酒精喂養(yǎng)小鼠予以低鐵處理后上述表現(xiàn)有一定程度的恢復(fù);對酒精暴露小鼠和酒精聯(lián)合高鐵喂養(yǎng)小鼠予以槲皮素干預(yù),與相應(yīng)的單純模型組和聯(lián)合喂養(yǎng)組相比,肝臟總鐵、LIP水平及FTL表達(dá)明顯下降,肝臟NCOA4、LC3II蛋白表達(dá)顯著增高,p62、FTH水平降低,肝臟NCOA4與FTH的共定位面積明顯增多。與正常小鼠相比,單純槲皮素或低鐵處理可明顯增加肝臟NCOA4蛋白表達(dá),促進(jìn)FTH和NCOA4的熒光共定位。與動(dòng)物結(jié)果一致,在腺病毒空載體組,與空載對照相比,酒精處理明顯降低HepG2細(xì)胞NCOA4、LAMP1蛋白水平,增高p62、FTH和FTL表達(dá),增加細(xì)胞內(nèi)普魯士藍(lán)鐵染色陽性,升高LDH釋放水平;與空載酒精組相比,NCOA4過表達(dá)的細(xì)胞經(jīng)酒精處理后,LAMP1蛋白水平明顯升高,p62、FTH、FTL水平降低,細(xì)胞內(nèi)鐵染色陽性下降,LDH釋放減少;空載酒精處理的細(xì)胞予以槲皮素干預(yù),其效應(yīng)與NCOA4過表達(dá)類似,均能明顯緩解酒精誘導(dǎo)的上述改變。4.與正常對照相比,慢加急性酒精攝入可明顯增加核CEBPβ表達(dá),降低細(xì)胞核FOXO1水平,免疫組化結(jié)果顯示FOXO1核定位減少;對酒精暴露小鼠予以槲皮素干預(yù),與酒精喂養(yǎng)小鼠相比,肝組織核CEBPβ水平降低,核FOXO1表達(dá)增高了77.1%(P0.05),FOXO1核定位增加。5.單獨(dú)酒精或AS處理,尤其是兩者聯(lián)合處理后,HepG2細(xì)胞p-FOXO1表達(dá)明顯增加,p62、FTH和FTL表達(dá)也隨之升高,TFEB蛋白表達(dá)和細(xì)胞活力下降,溶酶體pH升高;然而,AS并沒有引起酒精孵育的HepG2細(xì)胞NCOA4蛋白表達(dá)進(jìn)一步下降,但AS與酒精聯(lián)合孵育的細(xì)胞經(jīng)槲皮素干預(yù)后,p-FOXO1、p62、FTH和FTL水平均明顯降低,TFEB表達(dá)升高,溶酶體特異pH熒光標(biāo)記和細(xì)胞活力增加。結(jié)論:1.酒精攝入通過降低肝臟NCOA4蛋白和TFEB表達(dá),導(dǎo)致鐵噬的啟動(dòng)受阻和溶酶體功能受損,進(jìn)而誘導(dǎo)繼發(fā)性的肝鐵過載與損傷;槲皮素干預(yù)通過提高肝組織NCOA4蛋白和TFEB表達(dá),促進(jìn)鐵噬的啟動(dòng)和改善溶酶體功能,進(jìn)而拮抗酒精誘導(dǎo)的肝臟鐵過載性損傷。2.酒精升高了CEBPβ的表達(dá)和FOXO1的磷酸化,降低了FOXO1的核定位,但FOXO1轉(zhuǎn)錄抑制卻并沒有降低NCOA4的表達(dá),提示CEBPβ和FOXO1可能均非NCOA4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,但FOXO1可能參與了TFEB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。NCOA4轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【文章目錄】：
全文縮寫詞
摘要
Abstract
前言
1 材料和方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 Lieber De Carli liquid液體飼料配方
    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    1.4 主要試劑
    1.5 自配試劑
    1.6 動(dòng)物飼養(yǎng)
    1.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
    1.8 檢測指標(biāo)及方法
    1.9 NCOA4 轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測
    1.10 質(zhì)量控制
    1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 槲皮素與鐵處理對慢加急性喂養(yǎng)小鼠體重及肝體比的影響
    2.2 槲皮素與鐵處理對慢加急性喂養(yǎng)小鼠肝臟脂質(zhì)蓄積的影響
    2.3 槲皮素與鐵處理對慢加急性喂養(yǎng)小鼠肝臟損傷的影響
    2.4 槲皮素與鐵處理對慢加急性喂養(yǎng)小鼠肝臟鐵沉積的影響
    2.5 槲皮素與鐵處理對慢加急性喂養(yǎng)小鼠肝臟自噬水平的影響
    2.6 槲皮素與鐵處理對慢加急性喂養(yǎng)小鼠肝臟鐵噬水平的影響
    2.7 NCOA4 介導(dǎo)的鐵噬對HepG2 細(xì)胞鐵沉積的影響及槲皮素的干預(yù)效應(yīng)..
    2.8 槲皮素對慢加急性喂養(yǎng)小鼠肝臟核FOXO1 水平的影響
    2.9 FOXO1對TFEB表達(dá)與溶酶體功能的影響及槲皮素的干預(yù)效應(yīng)
3 討論
    3.1 慢加急性酒精攝入對小鼠肝鐵過載及肝損傷的影響
    3.2 慢加急性酒精攝入對小鼠肝臟FTL和 FTH蛋白表達(dá)的影響
    3.3 慢加急性酒精攝入通過降低NCOA4 表達(dá)抑制鐵噬的啟動(dòng),進(jìn)而誘導(dǎo)繼發(fā)性的肝鐵過載與損傷
    3.4 慢加急性酒精攝入降低肝臟TFEB表達(dá)使溶酶體功能受損,進(jìn)而加重對鐵噬的抑制
    3.5 槲皮素通過促進(jìn)NCOA4 表達(dá)誘導(dǎo)鐵噬的啟動(dòng),緩解酒精性肝鐵過載性損傷
    3.6 槲皮素增加TFEB蛋白表達(dá),改善溶酶體功能,促進(jìn)鐵噬的發(fā)生
4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2840273