發(fā)布時(shí)間：2020-10-13 23:13

　　 研究背景慢性非傳染性疾病(Non-communicable chronic diseases,NCDs)嚴(yán)重危害人民健康,其預(yù)防和控制刻不容緩。研究表明,食物中的植物化學(xué)物可通過發(fā)揮抗炎活性而達(dá)到防制NCDs的作用。大豆皂甙(Soyasaponin,SS)是廣泛存在于大豆及其制品中的一類植物化學(xué)物。近年來的研究表明SS具有抗炎活性,但其分子機(jī)理尚未徹底闡明。我們和其他實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),SS的抗炎活性可能與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)有關(guān),但SS調(diào)控TLR4信號(hào)通路的分子機(jī)理尚不清楚。目的本研究運(yùn)用脂多糖(Lipopolysacchrides,LPS)和棕櫚酸(Palmaticacid,PA)誘導(dǎo)建立巨噬細(xì)胞炎癥模型,研究三種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的大豆皂甙(A1、A2和I)對(duì)TLR4炎癥信號(hào)通路中信號(hào)分子表達(dá)的影響,旨在探討SS對(duì)TLR4信號(hào)通路的調(diào)控作用,闡明其抗炎活性的分子機(jī)理,為合理利用SS防制慢性炎癥介導(dǎo)的NCDs提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。方法1.實(shí)驗(yàn)分組(1)LPS和PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞.:分別采用濃度為1μg/mL LPS和 200 μmol/L PA 處理細(xì)胞不同時(shí)長(0 min、10 min、30 min、1h、3 h、6 h、12 h和24 h)。(2)SS干預(yù)LPS或PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞:不同濃度(10、20、40μmol/L)的SS(A1、A2、I)預(yù)孵育細(xì)胞2h,再根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,分別選擇合適的LPS或PA刺激細(xì)胞的處理時(shí)長,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組、1 μg/mLLPS陽性對(duì)照組或200 μmol/L PA陽性對(duì)照組。2.Western Blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)量收集細(xì)胞制備蛋白樣品,運(yùn)用Western Blotting方法檢測(cè)TLR4信號(hào)通路中信號(hào)分子(TLR4、MD-2、CD14、TIRAP、MyD88、TRAM、TRIF、IRAK4、IRAK1和TRAF6)的蛋白表達(dá)。使用Image J分析獲得目標(biāo)條帶的灰度值,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次,數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果以Mean±SEM表示,P0.05表示統(tǒng)計(jì)差異顯著。結(jié)果1.巨噬細(xì)胞LPS-TLR4炎癥信號(hào)通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)LPS處理1 h和3 h可增加MyD88的蛋白表達(dá)(P0.05);LPS刺激3 h可增加IRAK4磷酸化水平(P0.05);LPS刺激3 h、6 h和12 h能增加IRAK1磷酸化水平(P0.05);LPS刺激30 min、1 h、3 h和6 h能上調(diào)信號(hào)分子TRAF6的蛋白表達(dá)(P0.05),而LPS刺激12 h和24 h則下調(diào)了 TRAF6的蛋白表達(dá)(P0.05),隨著LPS刺激時(shí)間的增加,TRAF6蛋白表達(dá)呈先增加后降低的趨勢(shì)。2.SS(A1、A2、I)對(duì)LPS-TLR4炎癥信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)的調(diào)控LPS刺激1 h后,濃度為40 μmol/L的SS-A2和10 μmol/L SS-I能抑制由LPS引起的MyD88表達(dá)上調(diào)(P0.05);LPS處理時(shí)間為3h時(shí),不同濃度(10、20、40μmol/L)的 SS(A1、A2、I)能抑制 IRAK4 和 IRAK1 磷酸化水平(P0.05);LPS處理時(shí)間為12h時(shí),不同濃度(10、20、40μmol/L)的SS-A1和不同濃度(10、20 μmol/L)的SS-A2能拮抗由LPS引起的TRAF6蛋白表達(dá)下降(P0.05)。3.巨噬細(xì)胞PA-TLR4炎癥信號(hào)通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)PA刺激10min、30min、1h和3h可增加MyD88的蛋白表達(dá)(P0.05);與對(duì)照組相比,PA刺激10 min后,IRAK4磷酸化水平升高(P0.05),隨著刺激時(shí)間的延長(30min、1h、3h、6h、12 h和24h),IRAK4磷酸化水平持續(xù)升高(P0.05);PA刺激時(shí)間為30 min、1 h和3 h時(shí),IRAK1磷酸化水平升高(P0.05);PA刺激10min,TRAF6蛋白表達(dá)增加(P0.05),而PA刺激12 h時(shí),TRAF6的蛋白量表達(dá)下降(P0.05)。4.SS(A1、A2、I)對(duì)PA-TLR4炎癥信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)的調(diào)控不同濃度(10、20、40 μmol/L)的 SS(A1、A2、I)能抑制由 PA 刺激 30min后引起的MyD88蛋白表達(dá)增加(P0.05);不同濃度(20、40μmol/L)的SS-A1和不同濃度(10、20、40μmol/L)的SS(A2和I)能抑制由PA刺激30min引起的IRAK4磷酸化水平增加(P0.05);PA處理時(shí)間為30min時(shí),不同濃度(10、20、40μmol/L)的 SS(A1、A2、I)均能抑制 IRAK1 磷酸化水平(P0.05);PA刺激10 min時(shí),濃度為10 μmol/L和40 μmol/L的SS-I能抑制由PA引起的TRAF6蛋白表達(dá)上調(diào)(P0.05),PA刺激12h,不同濃度(10、20、40μmol/L)的SS(A1、A2)能拮抗PA引起的TRAF6蛋白表達(dá)降低。結(jié)論1.LPS和PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞都能增加TLR4炎癥信號(hào)通路中MyD88的表達(dá)以及促進(jìn)IRAK4和IRAK1的磷酸化,但其表達(dá)變化的時(shí)間不同。2.LPS和PA刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞,短時(shí)間內(nèi)能上調(diào)TRAF6的表達(dá),長時(shí)間則會(huì)抑制TRAF6的表達(dá),呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。3.在LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中,SS-A2和SS-I能抑制MyD88蛋白表達(dá);SS-A1、SS-A2和SS-I能抑制IRAK4和IRAK1的磷酸化;SS-A1和SS-A2可拮抗LPS長時(shí)間刺激而引起的TRAF6降低。4.在PA刺激的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中,SS-A1、SS-A2和SS-I能抑制MyD88的蛋白表達(dá)以及IRAK4和IRAK1的磷酸化;SS-A1和SS-A2可拮抗PA長時(shí)間刺激而引起的TRAF6蛋白表達(dá)量降低,SS-I可抑制PA短時(shí)間刺激而引起的TRAF6蛋白表達(dá)量升高。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

年代分離和鑒定了五種不同結(jié)構(gòu)的大豆皂甙［４６，?４７］，現(xiàn)根據(jù)大豆皂醇（也叫大豆??皂甙元）及其連接的糖側(cè)鏈不同將其分為Ａ組、Ｂ組、Ｅ組和ＤＤＭＰ大豆皂甙??［４８］（如圖１－１和表１－１所示）。其中，Ａ組大豆皂甙是一類以大豆皂甙元Ａ（ＳＧ－Ａ）??為配基，其Ｃ－２１位上連接羥基基團(tuán)，Ｃ－３和Ｃ－２２位上各連接一個(gè)糖基的雙糖鏈??皂甙。根據(jù)Ｃ－２２位上的終端糖單元是否含有乙�；譃槊撘阴；蠖乖磉埃ǎ粒�、??Ａ２、Ａ３、Ａ＊、Ａ５、八６）和乙酰化大豆阜試（Ａａ、Ａｂ、Ａｃ、Ａｄ、Ａｅ、Ａｆ、Ａｇ、??Ａｈ）。Ｂ組大豆皂甙是一種單糖，配基為大豆皂甙元Ｂ?（ＳＧ－Ｂ），結(jié)構(gòu)中Ｃ－２１位??連接的是一個(gè)氫原子，且僅在其Ｃ－３位上連接糖側(cè)鏈。它們被分類為大豆皂甙Ｉ、??ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ，而有科學(xué)家根據(jù)糖側(cè)鏈的不同將其命名為Ｂａ、Ｂｂ、Ｂｅ、Ｂｂ’、??４??

ＴＲＡＦ６分子［６５］。激活后的ＴＲＡＦ６分別通過ＮＦ－ｋＢ誘導(dǎo)激酶（ＮＩＫ）和ＭＡＰＫｓ??激酶（ＭＫＫ）激活ＮＦ－ｋＢ和ＭＡＰＫｓ信號(hào)通路［５９＇?６７］。另一方面通過ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ??途徑激活ＮＦ－ｋＢ信號(hào)通路［６９］。如圖１－２所示。??「免一冗?＾固４?＿??————??１／??ＴＲＩＦ?［ＴＲＡＦ６?＾?ＮＦ－ｋＢ??１?ＴＲＡＭ?Ｉ?＼??ｔｌｒ４?＼、??ｉ＿ｓ?丨匪?ｈ＿Ｍｓ］???ｃｎｓｔｏｒｙ????二＇??／??——？「ＩＲＦ５］?？?｜?ＩＲＦ５?：??圖１－２?Ｔｏｌｌ樣受體４信號(hào)通路示意圖［７（）］??Ｆｉｇ．?１－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＴＬＲ４?ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ??ＴＬＲ４信號(hào)通路介導(dǎo)的慢性低度炎癥對(duì)肥胖、ＩＩ型糖尿病等ＮＣＤｓ的發(fā)生和??發(fā)展起關(guān)鍵作用［７１］，本課題組前期研究以及其他課題組的相關(guān)報(bào)道均提示著大??９??

ｌｉｍｏｌ／Ｌ）的ＳＳ?（Ａｈ?Ａ２、Ｉ）預(yù)孵育后再經(jīng)ＬＰＳ刺激的細(xì)胞中ＣＤ１４、ＭＤ－２和??ＴＬＲ４的蛋白表達(dá)水平也沒有顯著差異（ｉ＞＞０．０５），表明ＳＳ不影響炎性巨噬細(xì)胞??中ＣＤ１４、ＭＤ－２和ＴＬＲ４的蛋白表達(dá)（圖３－４）。??３０??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2839830