目的:本實驗旨在觀察華蟾毒精(Cinobufagin,CBF)對人乳腺癌MCF-7細胞株的生長影響,并研究探討其可能的分子作用機制。方法:常規(guī)體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞株,取指數生長期的細胞傳代24 h后分別加入不同濃度(0.1,0.2,0.4,0.8和1.6μM)的CBF進行處理,分別繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72 h后,用CCK-8法檢測細胞增殖活性,紫杉醇(0.02,0.04,0.08,0.16和0.32μM)作為陽性藥物對照組,同時設置陰性對照組(空白組);不同濃度(0,0.2,0.4和0.8μM)的CBF作用于MCF-7細胞48 h后,Hoechst 33258染色下,通過熒光顯微鏡觀察MCF-7細胞的形態(tài)并分析凋亡情況;不同濃度(0,0.2,0.4和0.8μM)的CBF作用于MCF-7細胞48 h后,Annexin V-APC/7-AAD雙染法下,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,PI單染下,流式細胞儀分析細胞周期;不同濃度(0,0.2,0.4和0.8μM)的CBF作用于MCF-7細胞48 h后,實時熒光定量PCR法(RT-qPCR)檢測Bax和Bcl-2基因表達變化情況,Western-blot試驗檢測Bax和Bcl-2蛋白表達變化情況。結果:CCK-8試驗結果表明CBF可以抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖,并呈濃度和時間依賴性(P0.05),其24,48,和72 h的IC_(50)(半抑制濃度)分別為0.94,0.44和0.22μM,紫杉醇對照組MCF-7細胞24,48,和72h的IC_(50)分別為0.20,0.08和0.02μM;Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡下觀察,可見空白對照組為均勻彌散的藍色熒光,而藥物組細胞呈現(xiàn)明顯不均一的亮藍色熒光,提示CBF作用組MCF-7細胞發(fā)生了凋亡;Annexin V-APC/7-AAD雙染法后,流式細胞儀所測0.2,0.4和0.8μM藥物組凋亡細胞百分比分別為22.94%、50.68%和68.29%,而空白對照組凋亡細胞百分比為5.87%,結果表明CBF明顯誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡,并呈濃度依賴性(P0.05);PI單染后,流式細胞儀分析0.2,0.4和0.8μM藥物組G1細胞百分比分別為49.11%,57.54%和63.75%,而空白對照組為39.45%,提示CBF作用后的MCF-7細胞呈現(xiàn)G1期阻滯;實時熒光定量PCR法和Western-blot試驗顯示CBF作用于MCF-7細胞48h后Bax基因和蛋白表達上升,Bcl-2基因和蛋白表達下降,并呈濃度依賴性,且Bax/Bcl-2比例逐漸升高(P0.05)。結論:CBF能抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖并使細胞呈現(xiàn)G1期阻滯,具有時間和濃度依賴性;CBF能促進人乳腺癌MCF-7細胞凋亡,并呈濃度依賴性,其作用機制可能與上調Bax表達和下調Bcl-2表達有關。CBF可能是一種潛在的以Bcl-2家族為作用靶點的抗腫瘤活性物質。
【學位單位】：皖南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

規(guī)體外培養(yǎng)人乳腺癌 MCF-7 細胞株，取指數生長期細胞傳代 240，0.1，0.2，0.4，0.8 和 1.6 μM）CBF 分別作用 24，48 和 72 h。用 CCK-8 法檢測細胞活性，記錄結果并繪制細胞生長曲線，軟件F-7 細胞的 IC50在 24，48 和 72h 分別為 0.94，0.44 和 0.22 μM。照組，每組設三個復孔，在不同濃度（0，0.02，0.04，0.08,，0.16 和分別作用于 MCF-7 細胞 24，48 和 72 h 后， IC50分別為 0.20， 結果如圖 2 所示，隨著 CBF 作用濃度的增加，細胞的存活率下降（用時間的延長，細胞的存活率亦下降（圖 2，a），表明 CBF 對 M抑制作用呈時間和濃度依賴性（P < 0.05）；作為陽性對照，隨著增加，細胞的存活率下降（圖 2，d）；隨著作用時間的延長，細（圖 2，c），表明紫杉醇對 MCF-7 細胞的生長抑制作用呈時間 < 0.05）。

CBF 作用 MCF-7 細胞 48 h 后，Hoechst 33258 染色下熒光顯微儀的 MCF-7 細胞凋亡檢測結果0，0.2，0.4 和 0.8 μM）CBF 作用于 MCF-7 48 h 雙染下，流式細胞儀分析不同濃度組細胞凋亡情況（圖相比，藥物組細胞凋亡明顯增多；0.2 μM 藥物組、0.4 的細胞凋亡百分比分別為 22.94%、50.68%和 68.29%，而比僅為 5.87%；隨著 CBF 藥物濃度的增加，凋亡 MCF-有濃度依賴性（P < 0.05）。

26. （a）不同濃度 CBF 作用于 MCF-7 細胞 48 h 后，誘導細胞凋亡。左下象限：正�；罴毾笙蓿涸缙诘蛲黾毎疑舷笙蓿和砥诘蛲黾毎�，左上象限：死亡細胞。（b）隨著濃度的增加，凋亡細胞百分比逐漸上升，并呈濃度依賴性，*p< 0.05 vs. 空白對照組
【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 楊國旺;唐武軍;王笑民;;乳腺癌中醫(yī)研究若干問題思考及策略[J];北京中醫(yī)藥;2011年11期

2 夏俊;江敏;姜彥峰;;蟾酥及其有效成分體外抗腫瘤作用研究進展[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2008年08期

3 張英;邱鷹昆;劉珂;姜永濤;陳繼永;竇德強;;中華大蟾蜍的研究進展[J];中草藥;2006年12期

4 王鸝;吳軍;李敏;楊秀偉;崔景榮;;華蟾毒精抑制HeLa細胞增殖作用機制的探討[J];中華腫瘤雜志;2005年12期

5 趙建斌,崔勤,張雪,王文亮,蔣永培;華蟾毒精抗癌作用的體外研究[J];第四軍醫(yī)大學學報;2001年16期

相關碩士學位論文 前2條

1 王葉;蟾酥中強心苷類化學成分的研究[D];吉林大學;2015年

2 丁海玲;蟾蜍水提物誘導人肝癌SMMC7721細胞凋亡的初步研究[D];大連醫(yī)科大學;2008年

本文編號：2838514