目的:本實(shí)驗(yàn)旨在觀察華蟾毒精(Cinobufagin,CBF)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的生長(zhǎng)影響,并研究探討其可能的分子作用機(jī)制。方法:常規(guī)體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株,取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞傳代24 h后分別加入不同濃度(0.1,0.2,0.4,0.8和1.6μM)的CBF進(jìn)行處理,分別繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72 h后,用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,紫杉醇(0.02,0.04,0.08,0.16和0.32μM)作為陽性藥物對(duì)照組,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(空白組);不同濃度(0,0.2,0.4和0.8μM)的CBF作用于MCF-7細(xì)胞48 h后,Hoechst 33258染色下,通過熒光顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞的形態(tài)并分析凋亡情況;不同濃度(0,0.2,0.4和0.8μM)的CBF作用于MCF-7細(xì)胞48 h后,Annexin V-APC/7-AAD雙染法下,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,PI單染下,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期;不同濃度(0,0.2,0.4和0.8μM)的CBF作用于MCF-7細(xì)胞48 h后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-qPCR)檢測(cè)Bax和Bcl-2基因表達(dá)變化情況,Western-blot試驗(yàn)檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)變化情況。結(jié)果:CCK-8試驗(yàn)結(jié)果表明CBF可以抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖,并呈濃度和時(shí)間依賴性(P0.05),其24,48,和72 h的IC_(50)(半抑制濃度)分別為0.94,0.44和0.22μM,紫杉醇對(duì)照組MCF-7細(xì)胞24,48,和72h的IC_(50)分別為0.20,0.08和0.02μM;Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡下觀察,可見空白對(duì)照組為均勻彌散的藍(lán)色熒光,而藥物組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯不均一的亮藍(lán)色熒光,提示CBF作用組MCF-7細(xì)胞發(fā)生了凋亡;Annexin V-APC/7-AAD雙染法后,流式細(xì)胞儀所測(cè)0.2,0.4和0.8μM藥物組凋亡細(xì)胞百分比分別為22.94%、50.68%和68.29%,而空白對(duì)照組凋亡細(xì)胞百分比為5.87%,結(jié)果表明CBF明顯誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡,并呈濃度依賴性(P0.05);PI單染后,流式細(xì)胞儀分析0.2,0.4和0.8μM藥物組G1細(xì)胞百分比分別為49.11%,57.54%和63.75%,而空白對(duì)照組為39.45%,提示CBF作用后的MCF-7細(xì)胞呈現(xiàn)G1期阻滯;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western-blot試驗(yàn)顯示CBF作用于MCF-7細(xì)胞48h后Bax基因和蛋白表達(dá)上升,Bcl-2基因和蛋白表達(dá)下降,并呈濃度依賴性,且Bax/Bcl-2比例逐漸升高(P0.05)。結(jié)論:CBF能抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖并使細(xì)胞呈現(xiàn)G1期阻滯,具有時(shí)間和濃度依賴性;CBF能促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡,并呈濃度依賴性,其作用機(jī)制可能與上調(diào)Bax表達(dá)和下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。CBF可能是一種潛在的以Bcl-2家族為作用靶點(diǎn)的抗腫瘤活性物質(zhì)。
【學(xué)位單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

規(guī)體外培養(yǎng)人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞株，取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代 240，0.1，0.2，0.4，0.8 和 1.6 μM）CBF 分別作用 24，48 和 72 h。用 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，軟件F-7 細(xì)胞的 IC50在 24，48 和 72h 分別為 0.94，0.44 和 0.22 μM。照組，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，在不同濃度（0，0.02，0.04，0.08,，0.16 和分別作用于 MCF-7 細(xì)胞 24，48 和 72 h 后， IC50分別為 0.20， 結(jié)果如圖 2 所示，隨著 CBF 作用濃度的增加，細(xì)胞的存活率下降（用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率亦下降（圖 2，a），表明 CBF 對(duì) M抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性（P < 0.05）；作為陽性對(duì)照，隨著增加，細(xì)胞的存活率下降（圖 2，d）；隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)（圖 2，c），表明紫杉醇對(duì) MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈時(shí)間 < 0.05）。

CBF 作用 MCF-7 細(xì)胞 48 h 后，Hoechst 33258 染色下熒光顯微儀的 MCF-7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果0，0.2，0.4 和 0.8 μM）CBF 作用于 MCF-7 48 h 雙染下，流式細(xì)胞儀分析不同濃度組細(xì)胞凋亡情況（圖相比，藥物組細(xì)胞凋亡明顯增多；0.2 μM 藥物組、0.4 的細(xì)胞凋亡百分比分別為 22.94%、50.68%和 68.29%，而比僅為 5.87%；隨著 CBF 藥物濃度的增加，凋亡 MCF-有濃度依賴性（P < 0.05）。

26. （a）不同濃度 CBF 作用于 MCF-7 細(xì)胞 48 h 后，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。左下象限：正�；罴�(xì)象限：早期凋亡細(xì)胞，右上象限：晚期凋亡細(xì)胞，左上象限：死亡細(xì)胞。（b）隨著濃度的增加，凋亡細(xì)胞百分比逐漸上升，并呈濃度依賴性，*p< 0.05 vs. 空白對(duì)照組
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2838514