鹿茸作為一種傳統(tǒng)名貴藥材,有極高的藥用價(jià)值,但其質(zhì)量評(píng)價(jià)和鑒別方法不盡完善,導(dǎo)致市場(chǎng)上難以分辨梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸。本試驗(yàn)以梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸為實(shí)驗(yàn)材料,從五種鑒別方法(含量分析、色譜鑒別、SDS-PAGE電泳鑒別、光譜鑒別、DNA分子鑒別)對(duì)梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸進(jìn)行比較試驗(yàn),確定梅花鹿茸和花馬雜交鹿茸F1代鑒別的最適方法,為實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。含量測(cè)定分析:采用凱氏定氮法、高溫干燥法、灼燒法、索氏提取法、分光光度法分別對(duì)兩種鹿茸的蛋白質(zhì)、水分、灰分、粗脂肪、磷脂含量進(jìn)行了測(cè)定;采用原子吸收光譜法結(jié)合分光光度法測(cè)定了Ca、P、Na、K、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu無(wú)機(jī)元素的含量;采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定了As、Pb、Cd、Cr、Hg元素的含量;采用氨基酸分析儀結(jié)合分光光度法測(cè)定了兩種鹿茸氨基酸的含量。使用spss分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:梅花鹿茸粗灰分含量極顯著高于花馬F1代雜交鹿茸(P0.01),梅花鹿茸總磷脂含量顯著高于花馬雜交F1代鹿茸(P0.05)。梅花鹿茸K、Mn、Fe、Cu、Pb、Cd、組氨酸含量極顯著低于花馬雜交F1代鹿茸(P0.01)。梅花鹿茸Na、Hg、甲硫氨酸含量顯著低于花馬雜交F1代鹿茸(P0.05)。色譜鑒別:本實(shí)驗(yàn)按照2015版《中國(guó)藥典》中相關(guān)規(guī)定,并綜合薄層色譜法鑒別其他各種藥材的方法,從薄層色譜條件,顯色條件以及點(diǎn)樣量方面優(yōu)化處理,從而選擇出鑒別的最適用方法,結(jié)果:兩種鹿茸薄層圖譜斑點(diǎn)無(wú)顯著差異。運(yùn)用高效液相色譜鑒別,色譜條件AgilentHCC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),以0.1%磷酸水溶液-甲醇(體積比30:70)和乙腈-0.1%磷酸水(體積比30:70)為流動(dòng)相,流速0.5mL·min~(-1),檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm,柱溫25℃,進(jìn)樣量為20μL,梅花鹿茸在6min 300 mAU峰值的特征峰,在7min出現(xiàn)第二個(gè)峰,8min45s出現(xiàn)第三個(gè)峰值;而花馬雜交F1代鹿茸僅在7min出現(xiàn)第一個(gè)峰值,8min45s出現(xiàn)第二個(gè)峰值。SDS-PAGE電泳鑒別:用水提取梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸蛋白,利用SDS-PAGE電泳分析花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸的蛋白差異。結(jié)果:梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸的電泳圖譜有明顯區(qū)別,在12.5%、10.5%、7.5%分離膠系統(tǒng)中梅花鹿茸蛋白條帶數(shù)均高于花馬雜交F1代鹿茸,在10%、7.5%分離膠系統(tǒng)中,梅花鹿茸在116-97.2KD均出現(xiàn)條帶,花馬雜交F1代鹿茸均無(wú)條帶。光譜鑒別:本文用紫外光譜儀掃描梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸提取物190~400nm處波長(zhǎng),結(jié)果顯示梅花鹿茸水提物紫外峰值出現(xiàn)在204nm處,而花馬雜交F1代鹿茸紫外峰值出現(xiàn)在210nm處。在200nm處花馬雜交F1代鹿茸水提物出現(xiàn)峰谷,梅花鹿茸在200nm處無(wú)此峰谷;用紅外光譜儀掃描兩種鹿茸4000~450cm~(-1)波長(zhǎng)范圍的光譜圖。對(duì)兩種鹿茸紅外吸收峰進(jìn)行分析,梅花鹿茸在3500~3000cm~(-1)有O-H伸縮振動(dòng)有關(guān)的特征吸收峰,花馬雜交F1代鹿茸在3500~3000cm~(-1)沒(méi)有出現(xiàn)O-H伸縮振動(dòng)有關(guān)的特征吸收峰。紫外光譜法和紅外光譜法均可以區(qū)分梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸。DNA分子多樣性鑒別:本文采用隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性技術(shù)探索梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸DNA多態(tài)性差異。采用血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒方法,提取梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸DNA,選取20條隨機(jī)引物,對(duì)兩種鹿茸DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master Mix 12.5μL、隨機(jī)引物1μL(12.5μmol·L~(-1))、DNA模板1μL(0.5μg)、無(wú)菌雙蒸水10.5μL,總體系25μL。循環(huán)參數(shù)設(shè)置為:94℃預(yù)變性1min,94℃變形1min,45℃退火1.5min,72℃延伸1.5min,循環(huán)5次;94℃變性1min,50℃退火1.5min,72℃延伸1min,循環(huán)35次,72℃延伸5min,擴(kuò)增產(chǎn)物在80 v瓊脂糖電泳中跑30 min。得出隨機(jī)引物電泳圖譜,比較兩種鹿茸20條引物擴(kuò)增圖譜差異。梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸在引物1、4、5、9、11、16、17、18號(hào)引物中均沒(méi)條帶,在6、7、10、13、14、15、20號(hào)引物擴(kuò)增產(chǎn)物均有的條帶,花馬雜交鹿茸在3號(hào)引物中有特異性條帶3條,在12號(hào)引物中有特異性條帶4條;梅花鹿茸在2號(hào)引物中有特異性條帶1條,8號(hào)引物中有特異性條帶3條,19號(hào)引物中有特異性條帶4條。梅花鹿茸在同能擴(kuò)增條帶的7條引物中共有25條條帶,而花馬雜交F1代鹿茸有23條�；R雜交鹿茸F1代具有和梅花鹿茸相似的營(yíng)養(yǎng)成分,有較高的研究?jī)r(jià)值,本研究為鹿茸的鑒別研究提供輔助依據(jù);薄層色譜不能鑒別出梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸差別,高效液相色譜鑒別分析范圍廣、分離能力強(qiáng),分析時(shí)間快且定性分析結(jié)果可靠,可以很好的鑒別梅花鹿茸和花馬雜交F1代鹿茸;聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨力較強(qiáng)、識(shí)別度較高,適用于從兩種鹿茸的蛋白差異鑒別鹿茸種類(lèi);用光譜法測(cè)定鹿茸品種具有準(zhǔn)確度高,精密度好的特點(diǎn)。RAPD技術(shù)多態(tài)性豐富、檢出率高、技術(shù)簡(jiǎn)便,適用于鹿茸的快速鑒別,本實(shí)驗(yàn)中RAPD方法可以很好的將梅花鹿茸和花馬雜交鹿茸鑒別區(qū)分,為梅花鹿茸和花馬雜交鹿茸的鑒別提供了很好的遺傳學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R282.5
【部分圖文】：

后先在 80v 電壓下跑半小時(shí)，觀察凝膠板下端有氣泡向上冒出即樣品中蛋白在通電環(huán)境中運(yùn)動(dòng)。待樣品中的蛋白大分子都在分離膠與濃縮膠分層界面后（約半小時(shí)），調(diào)節(jié)電壓至 120v，樣品跑到膠板底部即可停止。電泳結(jié)束后，卸下硅橡膠框，用制造�？椎氖嶙虞p輕撬開(kāi)玻璃板，取出中間凝膠，將凝膠濃縮膠部分除去。放入培養(yǎng)皿中，加入考馬斯亮藍(lán)染色 3h。倒出考馬斯亮藍(lán)染色液，放入脫色液中脫色。脫色過(guò)夜，觀察蛋白質(zhì)條帶。2.3 結(jié)果2.3.1 梅花鹿茸和花馬雜交 F1 代鹿茸 12.5%分離膠電泳結(jié)果根據(jù)圖 2-1 和表 2-2，在 12.5%分離膠系統(tǒng)中，梅花鹿茸出現(xiàn) 15 條帶，117 KD以上有 3 條帶，117-90 KD 出現(xiàn) 2 條帶，90-49 KD 有 5 條帶，49-35 KD 有 2 條帶,35 KD 以下出現(xiàn) 3 條帶；花馬雜交 F1 代鹿茸出現(xiàn) 14 條帶，區(qū)別與梅花鹿茸條帶在 90-49 KD 出現(xiàn) 3 條帶，49-35 KD 有 3 條帶，其余與梅花鹿茸條帶出現(xiàn)位置一致。

后先在 80v 電壓下跑半小時(shí)，觀察凝膠板下端有氣泡向上冒出即樣品中蛋白在通電環(huán)境中運(yùn)動(dòng)。待樣品中的蛋白大分子都在分離膠與濃縮膠分層界面后（約半小時(shí)），調(diào)節(jié)電壓至 120v，樣品跑到膠板底部即可停止。電泳結(jié)束后，卸下硅橡膠框，用制造�？椎氖嶙虞p輕撬開(kāi)玻璃板，取出中間凝膠，將凝膠濃縮膠部分除去。放入培養(yǎng)皿中，加入考馬斯亮藍(lán)染色 3h。倒出考馬斯亮藍(lán)染色液，放入脫色液中脫色。脫色過(guò)夜，觀察蛋白質(zhì)條帶。2.3 結(jié)果2.3.1 梅花鹿茸和花馬雜交 F1 代鹿茸 12.5%分離膠電泳結(jié)果根據(jù)圖 2-1 和表 2-2，在 12.5%分離膠系統(tǒng)中，梅花鹿茸出現(xiàn) 15 條帶，117 KD以上有 3 條帶，117-90 KD 出現(xiàn) 2 條帶，90-49 KD 有 5 條帶，49-35 KD 有 2 條帶,35 KD 以下出現(xiàn) 3 條帶；花馬雜交 F1 代鹿茸出現(xiàn) 14 條帶，區(qū)別與梅花鹿茸條帶在 90-49 KD 出現(xiàn) 3 條帶，49-35 KD 有 3 條帶，其余與梅花鹿茸條帶出現(xiàn)位置一致。

表 2-2 12.5%分離膠系統(tǒng)鹿茸蛋白分子量電泳結(jié)果5% separation gel system antler protein molecular weight electro≥117KD 117-90 KD 90-49 KD 49-35 KD 35-+ 3 + 2 + 5 + 2 +茸 + 3 + 2 + 3 + 3 +，-表示無(wú)條帶。茸和花馬雜交 F1 代鹿茸 10.5%分離膠電泳結(jié)果-2 和表 2-3，在 10%分離膠系統(tǒng)中，梅花鹿茸有 11 條200-116KD 有 2 條帶，116-97.2KD 出現(xiàn) 1 條帶，97.-44.3KD 有 3 條帶，44.3KD 以下有 2 條帶；花馬雜交200KD 以上有 1 條帶，200-116KD、116-97.2KD 沒(méi) 出現(xiàn) 1 條帶，66.4-44.3KD 有 2 條帶，44.3KD 以下有統(tǒng)蛋白條帶差異顯著。

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本文編號(hào)：2831154