發(fā)布時(shí)間：2020-09-30 11:30

　　 目的:探討重樓皂苷Ⅰ對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的影響,并研究其潛在的作用機(jī)制。方法:1.采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)HCT116細(xì)胞的體外活性抑制,觀察不同濃度重樓皂苷Ⅰ對(duì)HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,計(jì)算半數(shù)抑制率(IC_(50));2.采用Hoechst33258染色法觀察梯度濃度(0.5,1,2μg/ml)重樓皂苷Ⅰ對(duì)HCT116細(xì)胞核形態(tài)及數(shù)量的影響;3.采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)梯度濃度(0.5,1,2μg/ml)重樓皂苷Ⅰ對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響;4.采用細(xì)胞免疫熒光和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)HCT116細(xì)胞微管的影響;5.采用自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)轉(zhuǎn)染法檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)HCT116細(xì)胞自噬的影響;6.采用激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ處理細(xì)胞后對(duì)ROS產(chǎn)生的影響;7.采用CCK8法檢測(cè)使用自噬抑制劑3-MA及活性氧抑制劑NAC預(yù)處理細(xì)胞后,再使用重樓皂苷Ⅰ對(duì)細(xì)胞活力的影響;8.采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)HCT116細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21,p27,cyclinB1,CDC2,CDC25C,P-CDC25C等,細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3,p62,p-AKT,AKT,p-mTOR和mTOR的表達(dá)。結(jié)果:1.重樓皂苷Ⅰ以劑量-時(shí)間依賴(lài)方式抑制HCT116細(xì)胞的體外增殖,其24h,48h,72h的IC_(50)分別是1.91±0.27,0.93±0.025,0.79±0.03μg/ml;2.Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)(0.5,1,2μg/ml)重樓皂苷Ⅰ處理組細(xì)胞數(shù)量減少,雙核細(xì)胞數(shù)量明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01);3.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),重樓皂苷Ⅰ處理細(xì)胞后可阻滯細(xì)胞周期在G2/M期;其中溶劑組G2/M期的比例是(23.07±1.65)%,給藥組(0.5,1,2μg/ml)的比例是(30.7±2.05)%,(46.5±2.9)%,(51.6±3.45)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。重樓皂苷Ⅰ未抑制G2/M期相關(guān)蛋白p21,p27,CDC2,CDC25C的表達(dá)和活性,相反卻有促進(jìn)作用;能夠降低cyclinB1蛋白的表達(dá);4.經(jīng)2μg/ml的重樓皂苷Ⅰ處理后的細(xì)胞,與溶劑組相比,細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)紊亂;5.通過(guò)自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞,經(jīng)2μg/ml重樓皂苷Ⅰ處理后,觀察到重樓皂苷Ⅰ能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬,且自噬蛋白LC3B-Ⅱ的表達(dá)升高,p62的表達(dá)降低,但是其上游通路蛋白P-AKT,P-mTOR蛋白的表達(dá)未發(fā)生明顯的改變;自噬抑制劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞后,再使用重樓皂苷Ⅰ處理細(xì)胞,其對(duì)細(xì)胞的抑制率明顯低于相同濃度重樓皂苷Ⅰ單獨(dú)處理組;6.重樓皂苷Ⅰ處理HCT116細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS;NAC預(yù)處理細(xì)胞后,再使用重樓皂苷Ⅰ處理細(xì)胞,其對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制率明顯低于相同濃度重樓皂苷Ⅰ單獨(dú)處理組;7.重樓皂苷Ⅰ通過(guò)誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞ROS蓄積,從而引起周期阻滯和自噬的產(chǎn)生。結(jié)論:重樓皂苷Ⅰ以劑量-時(shí)間依賴(lài)方式抑制HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng),引起細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)紊亂,通過(guò)誘導(dǎo)ROS蓄積將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,引起細(xì)胞自噬。
【學(xué)位單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R285
【部分圖文】：

圖 1 重樓皂苷Ⅰ作用 24, 48, 72 h 對(duì) HCT116 細(xì)胞的增殖抑制影響 Effect of Polyphyllin Ι on inhibition rate of HCT116 cells after 24, 48, 72 h

圖 2 重樓皂苷Ⅰ作用 HCT116 細(xì)胞 24 h 后對(duì)細(xì)胞核及細(xì)胞形態(tài)的影響（Hoechst33258, x400）Fig2 Effect of Polyphyllin Ι on nucleus and cell morphology of HCT116 cellsafter 24h （Hoechst33258, x400）

各組的 G1%，S%的比例逐漸下降，G2/M %的比例逐漸升高，溶劑組與給藥組 G2/M%的比例分別是(23.07±1.65)%，(30.7±2.05)%，（46.5±2.9)%，(51.6±3.45)%。結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加，重樓皂苷Ⅰ對(duì) G2/M 期阻滯作用增強(qiáng)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05，**P<0.01)。見(jiàn)圖 3，表 4。

【參考文獻(xiàn)】

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10 盧偉;胡s

本文編號(hào)：2830782