蛹蟲草[Cordyceps militaris(Vuill.)Fr.]既是我國傳統(tǒng)名貴中藥材,也是重要的林下食用菌資源,具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等諸多藥理作用。硒是人體必需的微量元素,缺硒會導(dǎo)致人體發(fā)生多種疾病,而硒缺乏在世界各地普遍流行。由于有機(jī)硒易于被動物吸收,具有較高生物利用率及毒性閾值等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)得到了人們廣泛關(guān)注。蛹蟲草具有良好的富硒能力,是珍貴的富硒食藥用菌,硒多糖兼具硒和多糖的生物活性,可作為理想的硒膳食補(bǔ)充劑進(jìn)行研發(fā)。為此,本論文以蛹蟲草為研究對象,通過添加無機(jī)硒對富硒蛹蟲草培養(yǎng)基配方及栽培條件進(jìn)行優(yōu)化,以獲得蛹蟲草富硒栽培技術(shù)。在此基礎(chǔ)上,研究了富硒蛹蟲草子座及蛋白質(zhì)中硒的分布規(guī)律,對硒多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并研究了硒多糖分離純化和結(jié)構(gòu)表征,同時對硒多糖抗氧化活性及體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了研究,為富硒蛹蟲草的開發(fā)利用提供了理論依據(jù),主要研究結(jié)果如下:(1)以富硒蛹蟲草產(chǎn)量和硒含量為指標(biāo),采用Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計方法,對影響栽培效果的9個因素進(jìn)行篩選,對關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化,得到富硒蛹蟲草最佳栽培培養(yǎng)基配方:葡萄糖20 g/L、蛋白胨12 g/L、磷酸二氫鉀3 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、檸檬酸三銨1 g/L、維生素B1 50 mg/L、亞硒酸鈉添加量240 mg/L、小麥600 g/L;最佳培養(yǎng)條件:常溫浸泡26 h,發(fā)菌培養(yǎng)溫度18℃,原基誘發(fā)溫度16℃,子座生長溫度22℃;在此條件下,富硒蛹蟲草產(chǎn)量為175.57 g/kg,子座硒含量為197.32μg/g。與普通蛹蟲草栽培相比,其產(chǎn)量、多糖及蟲草素含量分別提高了 9.04%、24.06%、69.42%。硒含量提高了 52.86 倍。(2)依據(jù)富硒蛹蟲草的生長曲線,對富硒蛹蟲草子座和蛋白質(zhì)中硒的分布規(guī)律進(jìn)行了研究,研究結(jié)果表明:蛹蟲草子座硒產(chǎn)量、硒含量、蛋白硒含量、蛋白硒占總硒比均隨著硒添加量的增加而增加,但蛋白硒占總硒比各處理組間差異不顯著(p0.05);相同硒添加量條件下,不同時期子座硒產(chǎn)量隨蛹蟲草的生長而增加,子座硒含量先下降后上升,在成熟期蛹蟲草子座硒含量顯著提高,蛋白硒含量和蛋白硒占總硒比呈下降趨勢(p0.05);富硒可顯著提高蛹蟲草堿溶性蛋白含量(p0.05),而高硒添加量(120 mg/kg)可顯著降低水溶性、鹽溶性及醇溶性蛋白在子座中含量(p0.05),且隨著蛹蟲草的生長4種蛋白組分含量逐漸降低;硒在4種蛋白組分中分布呈不均衡性,硒含量順序?yàn)閴A溶性蛋白水溶性蛋白鹽溶性蛋白醇溶性蛋白,但水溶性蛋白對硒具有更大的承載能力;富硒蛹蟲草不同分子量蛋白與硒結(jié)合量具明顯的負(fù)相關(guān)。(3)采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)面分析法,應(yīng)用水提法、微波提取法及超聲波-微波聯(lián)合提取技術(shù)對富硒蛹蟲草硒多糖提取進(jìn)行優(yōu)化,得富硒蛹蟲草硒多糖超聲波-微波聯(lián)合提取最佳工藝:超聲時間26.0 min、微波時間3.2 min、微波功率350 W、液料比32 mL/g,在此條件下,硒多糖提取率達(dá)5.05%。超聲波-微波聯(lián)合提取法具有提取時間短,提取率高,硒多糖抗氧化活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是硒多糖提取最優(yōu)方法。(4)利用DEAE-52和Sephacryl S-400層析柱純化得3對普通多糖及硒多糖,分別為 Se-/CMP-Ⅰ、Se-/CMP-Ⅱ、Se-/CMP-Ⅲ,且 Se-/CMP-Ⅲ 在子座中含量最高;HPSEC分析結(jié)果表明,除Se-/CMP-Ⅰ外,Se-/CMP-Ⅱ和Se-/CMP-Ⅲ為多糖均一級分,平均分子量基本一致;硒及糖醛酸含量測定結(jié)果表明,三個硒多糖級分硒含量依次為Se-CMP-ⅢSe-CMP-ⅡSe-CMP-Ⅰ,硒在高分子量級分中分布較多,且Se-/CMP-Ⅰ和Se-/CMP-Ⅱ及Se-/CMP-Ⅲ糖醛酸含量不存在顯著差異(p0.05);單糖組成富硒表明,Se-/CMP-Ⅱ主要由甘露糖、半乳糖及葡萄糖組成,Se-/CMP-Ⅲ為葡萄糖組成的均質(zhì)多糖,且CMP-Ⅱ與Se-CMP-Ⅱ單糖摩爾比一致;紅外光譜、1HNMR及13CNMR分析結(jié)果表明,富硒未改變Se-/CMP-Ⅱ和Se-/CMP-Ⅲ主體結(jié)構(gòu),Se-CMP-Ⅱ中硒可能通過0-6取代連接到碳骨架中,且取代發(fā)生位點(diǎn)主要發(fā)生于其支鏈的末端β-D-Glcf-(1→殘基上,并以硒酸酯形式存在,在Se-CMP-Ⅲ結(jié)構(gòu)中除0-6取代外,硒還可能是以取代→6)-α-D-Glcp-(1 →的C-6或→4)-α-D-Glcp-(1→殘基的C-2上的-OH形成的結(jié)構(gòu)形式存在。(5)為研究硒多糖構(gòu)效關(guān)系,對Se-/CMP-Ⅱ和Se-/CMP-Ⅲ體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明:富硒蛹蟲草與普通蛹蟲草相比,Se-CMP-Ⅱ和Se-CMP-Ⅲ總還原力、·OH自由基及ABTS+自由基清除率均顯著高于CMP-Ⅱ和CMP-Ⅲ(p0.01);Se-CMP-Ⅱ較CMP-Ⅱ?qū) 2-自由基清除率差異不顯著(p0.05),但Se-CMP-Ⅲ較CMP-Ⅲ對O 2-自由基清除率差異顯著(p0.01)。(6)在D-半乳糖誘導(dǎo)下構(gòu)建亞急性衰老動物模型,對Se-CMP-Ⅲ和CMP-Ⅲ體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行對比分析,研究結(jié)果表明:隨著Se-CMP-Ⅲ劑量的增加,小白鼠體重、T-AOC、T-SOD、GSH-Px及CAT活性隨之增加(p0.05),而肝、腎、心及血清中的MDA含量降低(p0.05),且Se-CMP-Ⅲ活性優(yōu)于CMP-Ⅲ,從而說明含硒基團(tuán)的引入可顯著提升CMP-Ⅲ的抗氧化活性,富硒蛹蟲草Se-CMP-Ⅲ是一種潛在的抗氧化和抗衰老功能食品資源。(7)利用環(huán)磷酰胺構(gòu)建小白鼠免疫抑制模型,對Se-CMP-Ⅲ和CMP-Ⅲ免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行評價,研究結(jié)果表明:Se-CMP-Ⅲ對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小白鼠免疫機(jī)能下降具有明顯的緩解作用,可顯著提高小白鼠體重、脾臟及胸腺指數(shù)、外周血白細(xì)胞數(shù)、血清Ig G、Ig A、IgM含量、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖能力(p0.05),同時可顯著提高脾、外周血淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+值,并可改善環(huán)磷酰胺造成的肝損傷。采用ELISA法對血清TNF-α IL-6、IL-2及IFN-γ含量進(jìn)行測定,表明Se-CMP-Ⅲ和CMP-Ⅲ能夠顯著提升血清中4個細(xì)胞因子水平(p0.05)。在相同劑量下,與CMP-Ⅲ相比,Se-CMP-Ⅲ具有更高的免疫調(diào)節(jié)活性,說明含硒基團(tuán)是Se-CMP-Ⅲ發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的重要結(jié)構(gòu)元件之一,Se-CMP-Ⅲ可作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑資源進(jìn)行研發(fā)。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S567.3;R284
【部分圖文】：

圖３－２富硒蛹蟲草子賣體中有機(jī)硒分布逡逑Ｆｉｇ３－２邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｏｒｇａｎｉｃ邋ｓｅｌｅｎｉｕｍ邋ｉｎ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ．邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ逡逑由圖３－２可知：硒大部分存在于可溶性蛋白分子中，占總硒含量的５５．８９％，其次分布逡逑于多糖中的硒，為１７．８３％，以核酸中分布的硒最少，其僅占樣品總硒含量的０．２８％。由此逡逑可見，富硒蛹蟲草中蛋白和多糖結(jié)合硒是硒在富硒蛹蟲草中的主要賦存形式。逡逑３．３．２．２子座硒含量變化逡逑３0０１邐Ｔ逡逑Ｉ—Ｓ；逡逑％邐卜￣Ｓ＊逡逑０－＾—邐邐邐邐邐邐邐邐．邐邐邐ｒ逡逑０邐６０邐１２０邐１８０邐２４０逡逑亞硒酸鈉添加量（ｍｇ／ｋｇ）逡逑圖３－３不同亞硒酸鈉添加量對富硒蛹蟲草砸含量的影響逡逑Ｆｉｇ３－３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｅｌｅｎｉｔｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｎ邋ｓｅｌｅｎｉｕｍ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ逡逑由圖３－３可知：在硒添加量３０？２４０邋ｍｇ／ｋｇ范圍內(nèi)，隨著亞硒酸鈉添加量的增加，子座逡逑－３６－逡逑

ｓ邋ｉｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｆｒａｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ邋ａｓ邋ａ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｅ富硒蛹蟲草成熟期（Ｓ４）四種蛋白含量的影響如圖３，隨著硒添加量的提高四種蛋白在富砸蛹蟲草中的含蛹蟲草堿溶性蛋白的含量，２４０邋ｍｇ／ｋｇ處理組其含量．１４％。方差分析結(jié)果表明，各處理組中，除１２０邋ｍｇ／ｋｇｋｇ處理組差異不顯著外（；？＞０．０５），其余各組間間在亞砸酸鈉添加量＜６０邋ｍｇ／ｇ時，蟲草子座中水溶性、（戶＞0．0５），可在１２０邋ｍｇ／ｋｇ和２４０邋ｍｇ／ｋｇ處理組中，以。逡逑１２０１邐■■水溶性２品逡逑＿鹽溶性蛋白Ｉ逡逑］00＿邐ａ邐ＪｌW醇？性蛋白；逡逑Ｔ邐ｂ邐丨 ■磁溶性銀白ｊ逡逑

圖３－９富硒蛹蟲草各蛋白組分中硒含量逡逑Ｆｉｇ３－９邋Ｓｅｌｅｎｉｕｍ邋ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｆｒａｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ．邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ逡逑由圖３－９可知：與各組分蛋白含量趨勢相同，各組分硒含量差異較大（；？＜０．０１），其逡逑中，堿溶性蛋白硒含量最高達(dá)５３．７０邋｜Ｌｉｇ／ｇＤＷ，占總蛋白硒的５９．７８％，其次為水溶性蛋白，逡逑其硒含量２６．９６邋呢／ｇＤＷ，鹽溶性蛋白和醇溶性蛋白硒含量較低，二者占蛋白總硒比均不足逡逑１０％。這表明堿溶性和水溶性蛋白是蛹蟲草蛋白與硒結(jié)合的主要組分。這與前人研宄巴西果逡逑［２８３］、小麥［２７８］及雙歧桿菌＿富硒的結(jié)果相一致。此外，結(jié)合以上蛋白含量測定結(jié)果可知，逡逑水溶性蛋白僅占總可溶蛋白含量的２０．９３％，而硒含量卻占蛋白總硒含量的３０．０１％，這表明逡逑相對于其他蛋白組分，蛹蟲草水溶性蛋白對硒具有更大的承載能力。逡逑３．３．４硒在蛹蟲草不同分子置蛋白中的分布逡逑ＫＤａ邋Ｍａｒｋｅｒ邋Ｂａｎｄｓ邋Ｇｒｏｌ，Ｐｓ逡逑ｉ２（）逡逑ｊ00邋—逡逑｜灥彐ｎ＞逡逑Ｌ逡逑２０VW－ｖ逡逑桯ＶＩ逡逑圖３－１０富硒蛹蟲草總蛋白ＳＤＳ＾ＰＡＧＥ圖譜逡逑Ｆｉｇ３－１０邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋Ｓｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ邋Ｃ．邋ｍｉｌｉｔａｒｉｓ逡逑利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ對富砸蛹蟲草總蛋白進(jìn)行分離

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2829668