【摘要】：雄黃入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有解毒殺蟲,燥濕祛痰,截瘧的功效,在我國的臨床使用己有幾千年的歷史。從20世紀(jì)50年代以來,就有國內(nèi)醫(yī)者將含雄黃的復(fù)方制劑或單方用于醫(yī)治血液系統(tǒng)疾病、惡性淋巴系統(tǒng)疾病乃至實(shí)體瘤,取得了顯著的治療效果。但是由于具有毒性,故雄黃及其含有雄黃的成方制劑的安全使用就顯得至關(guān)重要。雄黃的毒性不僅和雄黃中砷的總量有關(guān),還和砷的化學(xué)形態(tài)及其代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。不同價(jià)態(tài),不同化學(xué)形式的砷化合物,其毒性可相差成千上萬倍。腸道是口服藥物在體內(nèi)代謝的重要場所,腸道內(nèi)寄生的大量細(xì)菌對藥物的生物轉(zhuǎn)化起到了非常重要的作用。目的:通過測定雄黃中的總砷,并對雄黃中的可溶性砷的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,檢測雄黃中可溶性砷的砷形態(tài),初步研究As單元素和雄黃中可溶性砷在腸道菌群作用下的砷形態(tài)及砷代謝,測定腸道菌群中的還原型谷胱甘肽(GSH),為闡述腸道菌群中砷形態(tài)的生物轉(zhuǎn)化奠定一定的基礎(chǔ)。方法:1.采用微波消解-氫化物原子吸收光譜儀和微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)分別對雄黃中的總砷進(jìn)行測定。2.利用Plackett-Burman和Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化雄黃中可溶性砷的提取工藝。3.建立高效液相色譜(HPLC)—電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)分離檢測AsB、AsC、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA六種砷形態(tài)化合物的方法,并檢測As單元素和雄黃在腸道菌群作用下的砷形態(tài)。4.建立DTNB法測定腸道菌群中還原型谷胱甘肽(GSH)。結(jié)果:1.微波消解-氫化物原子吸收光譜儀和微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測定雄黃中的砷含量以二硫化二砷(As2S2)計(jì)分別為96.20%和97.07%。2.利用Plackett-Burman和Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化雄黃中可溶性砷的最佳提取工藝為:以水作為提取溶劑,雄黃15mg,水10mL,提取溫度80℃,超聲提取3次,每次60min,雄黃中可溶性砷占總砷的4.16%。3.建立高效液相色譜(HPLC)—電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)分離檢測AsB、AsC、As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA六種砷形態(tài)的方法,采用DionexIonPacTMAS7RFICTM陰離子交換色譜柱(4x250 mm)作為分析柱,流動相A相:3.75 mM碳酸銨,流動相B相:100 mM碳酸銨。梯度洗脫,0.00～3.40 min,100%A;3.50 min 20%A,80%B;4.50～6.00 min 100%B;6.10～8.00 min 100%A。流速為1.2mL/min,進(jìn)樣體積為20μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,六種砷形態(tài)的線性范圍為 1～100 ng/mL,R2 均大于 0.9990,檢出限為 0.1～0.2ng/mL,精密度 RSD 在 0.93%-1.83%,均小于2%。方法加標(biāo)回收率為97.28%～105.24%,RSD均小于6%。采用優(yōu)化后的最佳提取工藝提取雄黃中的可溶性砷。結(jié)果表明:雄黃可溶性砷中的砷形態(tài)為As(Ⅲ)、As(V),且As(Ⅲ)含量高于As(V)。As單元素中只含有As(V)。采用超聲水浴的方法對腸道菌群樣品進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:雄黃可溶性砷與As單元素在腸道菌群的作用下,通過HPLC-ICP-MS只檢測到的砷形態(tài)為As(Ⅲ)、As(V)。4.通過DTNB法測定0-48h腸道菌群中還原型谷胱甘肽(GSH),在0～2 h未檢測到GSH,在4 h時(shí)達(dá)到峰值50.36μg/mL,12～48h 趨于穩(wěn)定,48h 為 13.30μg/mL。結(jié)論:1.雄黃中的砷含量以二硫化二砷(As2S2)計(jì)均大于2015版《中國藥典》規(guī)定的90%,符合藥典要求。2.Plackett-Burman和Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化雄黃中可溶性砷的提取工藝穩(wěn)定可靠,實(shí)驗(yàn)精度高,與模型預(yù)測值基本一致。3.建立HPLC-ICP-MS同時(shí)測定六種砷形態(tài),該方法采用As-7陰離子色譜柱分離六種砷形態(tài)化合物,分離效果良好,各砷形態(tài)化合物都達(dá)到了完全分離,能使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠,可運(yùn)用于雄黃中可溶性砷的砷形態(tài)、腸道菌群中的砷形態(tài)分析。4.首次通過DTNB法測定腸道菌群中的GSH,表明腸道菌群中存在還原型谷胱甘肽(GSH),可能對無機(jī)砷的甲基化代謝過程有著重要的作用,對于無機(jī)砷在腸道菌群內(nèi)的甲基化代謝過程還需進(jìn)行更為深入的研究。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

３．１提取溶劑的選擇逡逑對“２．３．１”項(xiàng)下不同提取溶劑制備的樣品溶液進(jìn)行測定，樣品溶液可溶性砷的測定逡逑按照“２．２．１”項(xiàng)下ＩＣＰ－ＭＳ參數(shù)進(jìn)行測定。結(jié)果如圖１所示。逡逑可溶性砷含量（ｍｇ／ｇ）逡逑１５邐１２．０２逡逑0逡逑５邐■■■■Ｈｉ逡逑０逡逑水邋０．５％磷酸邋１％磷酸邋２％磷酸人工腸液人工胃液逡逑圖１不同提取溶劑對雄黃中可溶性砷的影響逡逑從圖１可以看出，水作為提取溶劑，可溶性砷的含量明顯高于其他提取溶劑，最終逡逑選用水作為雄黃中可溶性砷的提取溶劑。逡逑３．２邋Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設(shè)計(jì)篩選顯著性因素逡逑Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂ＿ａｎ設(shè)計(jì)生成的１２次實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)平行３次，按“２．１．４”項(xiàng)下制備逡逑方法進(jìn)行１２組實(shí)驗(yàn)各樣品溶液的制備，樣品溶液可溶性砷的測定按照“２．２．１”項(xiàng)下ＩＣＰ－逡逑ＭＳ參數(shù)進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以提取率的３次平均值為考察指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表６，邋５逡逑３５逡逑

逡逑個(gè)因素對考察指標(biāo)影響的主次見圖２。雄黃的總砷含量己在“第二章”中進(jìn)行了測定，逡逑以雄黃樣品的含砷量以二硫化二砷（Ａｓ２Ｓ２）計(jì)為９７．０７％，總砷含量為６８．０４％。逡逑表６邋Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（ｎ＝３）逡逑因素逡逑運(yùn)行順序邐Ｔ邐ｔ邐ｎ邐Ｖ邐Ｄ邐提取率（％）逡逑１邐＿邐？邐－邐＋邐＋邐１．３８５逡逑２

Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩選出了邋３個(gè)比較顯著的影響因素，因此提取優(yōu)化中以提逡逑取率的最大值為目標(biāo)，通過Ｍｉｎｉｔａｂ軟件中ＤＯＥ功能中的響應(yīng)曲面的響應(yīng)優(yōu)化器，對目逡逑標(biāo)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖３所ＺＫ，確定優(yōu)化提取工藝為提取溫度為８０邋Ｃ，超尸提�。冲义洗�，提取時(shí)間為每次６０邋ｍｉｎ。逡逑|儒翁崛〈問奔溴義憲礤危福埃板危常板危梗埃板義希模哄澹保埃埃板吻咤危郟福埃埃蒎危郟常埃蒎危郟叮埃啊垮義希咤蔚灣危

本文編號：2829270