中藥復(fù)雜體系的化學(xué)表征有助于闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、完善其質(zhì)量控制體系,從而推進(jìn)中藥的標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化。但中藥成分類型多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、含量差異大,如何高效、靈敏地靶向表征中藥的活性成分,是中藥化學(xué)表征中亟待解決的關(guān)鍵問題。本論文以三七及相關(guān)制劑為研究對(duì)象,基于超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析平臺(tái),結(jié)合智能自動(dòng)化分析軟件,從色譜分離-數(shù)據(jù)挖掘兩個(gè)方面,開展化學(xué)表征新方法研究。提出了“離線二維分離-擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫(kù)匹配”的策略,用于三七總皂苷制劑及三七葉中皂苷成分的靶向表征,并根據(jù)三七總皂苷制劑表征結(jié)果進(jìn)行不同廠家的三七總皂苷制劑的比較,根據(jù)三七葉成分表征結(jié)果進(jìn)行新穎皂苷成分的靶向分離。1.結(jié)合正交的HILIC和反相色譜分離機(jī)制,構(gòu)建了離線全二維液相(2D LC)分離系統(tǒng)。該系統(tǒng)的理論峰容量和正交性分別為8976和0.84。通過(guò)串聯(lián)QTOF高分辨質(zhì)譜,采用碎片特征性強(qiáng)的fast DDA掃描模式,從血栓通注射劑中共鑒定了148個(gè)皂苷成分。該研究為微量、痕量皂苷成分的暴露和分離提供了方法參考,同時(shí)闡明了血栓通注射劑的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),為其質(zhì)量控制研究提供了依據(jù)。2.基于前述三七皂苷成分的研究,采用非靶向植物代謝組學(xué)方法,對(duì)多廠家的130批血栓通制劑與血塞通制劑進(jìn)行系統(tǒng)的分析。結(jié)果表明血栓通與血塞通之間以及不同劑型之間化學(xué)成分均無(wú)明顯差別;梧州制藥產(chǎn)血栓通與其他廠家的血栓通、血塞通成分差異明顯,結(jié)合三七總皂苷定性分析結(jié)果,通過(guò)OPLS-DA共鑒定差異成分20個(gè),其中Rd周圍原人參二醇型皂苷成分在梧州制藥產(chǎn)血栓通中的含量明顯低于其他廠家。另外,采用相同方法對(duì)三七不同部位進(jìn)行分析,共鑒定三七主根與三七剪口的差異成分15個(gè)。差異成分關(guān)聯(lián)分析表明,制劑成分差異與三七投藥部位無(wú)關(guān)。該研究為三七總皂苷制劑質(zhì)量控制體系的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。3.基于已構(gòu)建的離線二維系統(tǒng),提出了“離線二維分離-擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫(kù)匹配”的研究策略,對(duì)三七葉皂苷成分進(jìn)行系統(tǒng)表征。基于UNIFI智能軟件平臺(tái),通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配對(duì)2D LC QTOF MS采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析。針對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配受限于化合物數(shù)目的問題,我們提出了代謝物預(yù)測(cè)法進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)擴(kuò)展。以丙二酰基、葡萄糖、鼠李糖和木糖作為修飾基團(tuán),經(jīng)過(guò)兩步結(jié)構(gòu)修飾,將三七數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物數(shù)目擴(kuò)大14倍,化合物匹配數(shù)目為原數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的2.56倍。最終從三七葉中共鑒定了945個(gè)皂苷成分,其中662個(gè)為人參屬潛在的新化合物。以上基于UNIFI軟件的擴(kuò)展數(shù)據(jù)庫(kù)匹配方法大大簡(jiǎn)化了鑒定流程,與離線二維方法結(jié)合使用,實(shí)現(xiàn)了中藥單味藥材中化合物鑒定數(shù)目的突破。同時(shí),該研究為人參屬新穎皂苷結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。4.開展了LC-MS導(dǎo)向的三七葉化學(xué)分離研究,對(duì)以上潛在新穎皂苷成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。綜合運(yùn)用多種色譜及波譜技術(shù),最終從三七葉中分離并鑒定了19個(gè)新化合物,包括3個(gè)降三萜皂苷(notoginsenosides L1-L3)、1個(gè)3-OH乙�；碥�(notoginsenoside L4)、8個(gè)3-OH丙二�；碥�(notoginsenosides L5-L12)及7個(gè)C-17側(cè)鏈雜化型皂苷(notoginsenosides L13-L19)。其中,8個(gè)3-OH丙二�；碥赵谌呷~和三七花中含量較高,而在三七根中含量較低,可以作為潛在的質(zhì)量標(biāo)志物用于區(qū)分三七地上部分和地下部分。綜上,本論文建立了三七皂苷成分的靶向表征方法,系統(tǒng)分析了三七及其相關(guān)制劑的化學(xué)成分,同時(shí)不同廠家制劑的成分進(jìn)行比較,并對(duì)三七葉中潛在新穎成分進(jìn)行分離,為三七及其相關(guān)制劑質(zhì)量控制研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為中藥復(fù)雜體系的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的策略和方法。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284
【部分圖文】：

第 2 章 離線 2D LC-MS 用于血栓通注射劑的系統(tǒng)表征Sartorius CP224S 電子天平 (SartoriusInc., Germany)；Elmasonic P 180H 超聲波清洗儀 (Elma, Germany)；L530 離心機(jī) (湖南長(zhǎng)沙湘儀檢測(cè)設(shè)備有限公司)。Agilent 1100 液相系統(tǒng)，配有 VWD 檢測(cè)器、四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器及在線脫氣機(jī)，采用 Agilent ChemStation A 10.02 色譜工作站。Waters ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相系統(tǒng)，配有 PDA 檢測(cè)器、二元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器及脫氣機(jī)，串接 Xevo G2-S QTOF 質(zhì)譜儀。配有 Masslynx4.1 工作站。

2.2.1.1 色譜柱篩選以三七藥材樣品 (34#主根)進(jìn)行色譜柱的篩選。采用的色譜條件如下：乙腈(A)-2 mM AA (B)為流動(dòng)相，30°C 柱溫，0.3 mL/min，使用梯度洗脫：0-3 min,18%-24% (A); 3-6.5 min, 24%-25% (A); 6.5-7 min, 25%-33% (A); 7-13 min, 33%(A); 13-16 min, 33%-55% (A); 16-17 min, 55%-95% (A); 17-21 min, 95% (A)。反相色譜已經(jīng)被廣泛用于人參類藥材的分析中，具有較好的選擇性8, 34,35。因此，本實(shí)驗(yàn)中首先考察 6 款 RP C18 對(duì)三七皂苷分離的選擇性，作為第二維色譜柱:Waters的HSST3,BEHC18, CSHC18;Agilent SBC18,SB-Aq及PhenomenexKinetexXB-C18 (圖 2.2)。結(jié)果顯示，HSST3 與 CSHC18 對(duì)于皂苷成分表現(xiàn)出較強(qiáng)的保留能力，特別是對(duì)于大極性皂苷 (BPC 中 noto-R1 之前的成分群)。進(jìn)一步比較，HSS T3 柱在中等極性區(qū)域 (BPC 圖中 Rg1 與 Rb1 之間)能夠分離出的色譜峰更多。根據(jù)柱效和保留能力，最終選用 HSS T3 作為第二維色譜柱。

基于化學(xué)表征-數(shù)據(jù)挖掘的三七和相關(guān)制劑的質(zhì)量控制研究對(duì)于第一維的 HILIC 分離，我們對(duì)流動(dòng)相和柱溫進(jìn)行考察，以期獲得最佳譜分離條件�？疾斓牧鲃�(dòng)相包括乙腈-水，乙腈-0.1%FA 及乙腈-2mMAA(圖 2.7)。結(jié)果，當(dāng)水相中加入 0.1% FA 或 2mM AA 時(shí)，三七皂苷在 HILIC 色譜柱上的保為沒有明顯的影響。為了使流份便于制備分析，最終采用乙腈-水作為流動(dòng)相考察柱溫對(duì)于三七皂苷在 HILIC色譜柱上保留行為的影響，包括 25°C, 305°C 以及 40°C (圖 2.8)。結(jié)果顯示，當(dāng)柱溫在 25°C-40°C 內(nèi)升高時(shí)，三七皂 HILIC 柱上的保留能力減弱。相對(duì)地，當(dāng)柱溫設(shè)置為 25°C，色譜圖中間的以與 noto-R1 及 Rd 實(shí)現(xiàn)分離。因此，最終選擇 25°C 的柱溫。

本文編號(hào)：2828381