目的:以大鼠心肌細(xì)胞H9C2細(xì)胞為研究對(duì)象,從細(xì)胞水平構(gòu)建缺氧復(fù)氧損傷模型,模擬心臟MIRI。通過蔥白提取物單體硫化物二丙基二硫(S1),對(duì)缺氧復(fù)氧模型細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,觀察檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化,探討蔥白提取物單體硫化物S1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡途徑中的作用機(jī)制。方法:培養(yǎng)大鼠H9C2心肌細(xì)胞,隨機(jī)分組為7組,采用MTT法在24h下檢測(cè)正常對(duì)照組(con組)、溶劑對(duì)照組(0.1%DMSO)、不同濃度的S1處理組(1μg/ml,10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml)H9C2細(xì)胞活性;制備模型:將H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為4組,正常對(duì)照組(con組)、缺氧4h復(fù)氧0h(4h/0h)、缺氧4h復(fù)氧4h(4h/4h)、缺氧4h復(fù)氧16h(4h/16h),通過Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78表達(dá)情況,確定缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的時(shí)間,構(gòu)建H9C2細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型;根據(jù)前期結(jié)果將H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組,正常對(duì)照組(con組)、不同濃度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)S1預(yù)處理30min后的缺氧復(fù)氧組、缺氧復(fù)氧組(H/R組)。Annexin V-FITC/PI雙染色和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞凋亡情況。熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)胞內(nèi)相關(guān)蛋白GRP78,CHOP,caspase-3、Bcl-2表達(dá)情況。結(jié)果:1.MTT結(jié)果顯示:蔥白提取物單體硫化物S1的濃度為10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml能促進(jìn)細(xì)胞增殖(P0.01),S1濃度為1000μg/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞有毒性作用(P0.01),低濃度溶劑(0.1%DMSO)及S1濃度為1μg/ml對(duì)細(xì)胞無明顯影響(P0.05);2.缺氧復(fù)氧H9C2細(xì)胞損傷模型條件:與con組比,細(xì)胞缺氧4h,復(fù)氧0h、16h后,GRP78的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P0.05)。在缺氧4h復(fù)氧4h時(shí),GRP78上調(diào)結(jié)果顯著(P0.05),由此確立誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的缺氧復(fù)氧模型;10-1000μg/ml范圍內(nèi),細(xì)胞存活率明顯升高,細(xì)胞凋亡率明顯下降。3.Annexin V-FITC/PI雙染色和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè):經(jīng)過S1預(yù)處理后,在4.熒光定量PCR和Western blot檢測(cè):內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、caspase-3表達(dá)量較H/R組明顯下降,而抗凋亡蛋白Bcl-2明顯上調(diào)(P0.05)。結(jié)論:1.蔥白提取物單體硫化物S1在10-100μg/ml濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)H9C2細(xì)胞增殖,呈濃度依賴性。2.缺氧復(fù)氧損傷能使心肌細(xì)胞存活率顯著性降低,細(xì)胞凋亡率明顯增高,經(jīng)蔥白提取物單體硫化物S1預(yù)處理,可降低細(xì)胞凋亡率。3.蔥白提取物單體硫化物S1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,可能通過GRP78,CHOP,caspase-3蛋白上調(diào)表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：湖北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

湖北民族大學(xué)碩士學(xué)位論文22如圖3-1所示，與正常對(duì)照組（con）對(duì)比，溶劑對(duì)照組（0.1%DMSO）與濃度為1μg/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活率沒有影響，并且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明低濃度的溶劑與藥物對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用。當(dāng)濃度大于10μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率與濃度呈正相關(guān)性，且都高于con組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。當(dāng)濃度為1000μg/ml時(shí)，與con組相比

第二章 實(shí)驗(yàn)研究23圖3-2 不同復(fù)氧時(shí)間對(duì)H9C2細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)的影響Fig.3-2 Effects of different reoxygenation time on GRP78 protein expression in H9C2 cells注：*表示與空白對(duì)照組相比較，*：P＜0.055.3 Annexin V-FITC 法流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9C2 心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)饑餓處理，分別用不同濃度S1預(yù)處理30min后通過FITC和PI相結(jié)合，其檢測(cè)結(jié)果如下圖3-3所示。本實(shí)驗(yàn)主要分析早期凋亡細(xì)胞，從而計(jì)算凋亡率。如圖3-4所示，con組凋亡率為（5.13±0.42）%、H/R 組凋亡率為（22.30±2.16）%，不同濃度S1預(yù)處理組凋亡率分別為（12.0±0.10）%

24100μg/ml con圖3-3 流式細(xì)胞儀上各組細(xì)胞凋亡情況Fig. 3-3 Cell apoptosis in each group on flow cytometry圖3-4 Annexin V-FITC 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率Fig. 3-4 Annexin V-FITC flow cytometry to detect apoptotic rate in each group注：*表示與空白對(duì)照組相比較，**：P＜0.01▲表示與H/R模型組相比較，▲▲：P＜0.015.4熒光定量PCR 檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、caspase-3 、Bcl-2基因表達(dá)5.4.1 熒光定量PCR測(cè)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白分子GRP78 的mRNA表達(dá)本實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參，通過使用2-ΔΔCT計(jì)算結(jié)果表明，對(duì)比con組，H/R 組和SI預(yù)處理組的GRP78mRNA的表達(dá)均有明顯上調(diào)，H/R是con組的2.66±0

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本文編號(hào)：2826526