目的:肝纖維化是由于病毒感染、藥物、酒精等多種病因所導(dǎo)致的慢性肝炎的共同病理改變,主要表現(xiàn)為肝臟細(xì)胞外基質(zhì)異常增生與過(guò)度沉積,關(guān)鍵在于肝星狀細(xì)胞的活化。肝纖維化進(jìn)行性加重,將進(jìn)展為肝硬化,甚至肝癌。目前臨床仍缺乏有效的抗肝纖維化的藥物。我們前期針對(duì)肝纖維化的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn),自擬益氣活血方對(duì)肝纖維化治療療效明確,但機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。近來(lái),多項(xiàng)研究顯示Hippo-YAP1通路的失調(diào)與肝纖維化存在直接的關(guān)系。因此,本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討益氣活血方調(diào)控Hippo-YAP1通路的關(guān)鍵因子抗肝纖維化的作用,以期為抗纖維化的新藥研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。方法:選用健康雄性Wistar大鼠,隨機(jī)分為3組:1)對(duì)照組(n=6),給予正常飲食及相同方法給予等量助溶劑(腹腔注射橄欖油代替30%CCl4,生理鹽水灌胃代替益氣活血沖劑灌胃);2)模型組(n=6),正常飲食,同時(shí)以30%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)橄欖油溶液腹腔注射,用量為0.2ml/100g,同時(shí)生理鹽水灌胃,每周2次;3)益氣活血組(n=6),正常飲食,以30%CCl4橄欖油溶液腹腔注射,每周2次,并給予益氣活血沖劑(3.4g/10ml/Kg/d)灌胃,飼養(yǎng)8周后處死動(dòng)物。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察肝組織炎癥水平。Masson三色染色觀察肝組織纖維化程度。免疫組化學(xué)檢測(cè)Hippo-YAP1通路關(guān)鍵因子下游轉(zhuǎn)錄因子Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)及其靶基因結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)等。用Western blot技術(shù)檢測(cè)肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)蛋白以及Hippo通路關(guān)鍵因子的表達(dá),用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Hippo通路關(guān)鍵靶基因的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析,組間比較采用LSD檢驗(yàn),P0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.肝組織病理學(xué)觀察和肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的改變:各組肝組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常,CCl4肝纖維化模型組中央小靜脈間纖維間隔相互連接,肝結(jié)構(gòu)變形。益氣活血方干預(yù)組大鼠肝纖維化程度明顯減輕。CCl4肝纖維化模型組α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和益氣活血組,益氣活血組α-SMA的蛋白表達(dá)下調(diào)。2 Hippo-YAP1通路關(guān)鍵基因蛋白及mRNA表達(dá)水平的變化2.1肝組織Hippo通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)水平:與對(duì)照組和益氣活血組相比,模型組大鼠肝臟YAP1蛋白表達(dá)水平顯著增高(P0.05),而磷酸化YAP1及上游關(guān)鍵因子MST2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MST1蛋白表達(dá)水平在三組中無(wú)明顯差異。2.2肝組織Hippo通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平:與對(duì)照組相比,模型組大鼠肝臟YAP1和TAZ mRNA表達(dá)水平顯著下降(P0.001)。模型組和益氣活血方干預(yù)組相比,YAP1mRNA表達(dá)下降(P0.001)。而模型組和益氣活血方干預(yù)組大鼠肝臟TAZ mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異。模型組大鼠肝臟CTGF、AREG mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和益氣活血方干預(yù)組(P0.001),同時(shí)Hippo-YAP1通路中YAP1上游關(guān)鍵因子MST1、LATS1、LATS2 mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組和干預(yù)組(P0.05)。三組大鼠肝臟MST2 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異。3.免疫組織化學(xué)的分析:模型組大鼠肝組織中YAP1表達(dá)明顯高于正常組和益氣活血組(P0.05)。模型組中YAP1上游因子MST1和LATS1明顯低于益氣活血方干預(yù)組(P0.05)。YAP1靶基因CTGF在模型組中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組和益氣活血方干預(yù)組(P0.05)。結(jié)論:1.腹腔注射CCL4的方法可成功建立大鼠肝纖維化模型。2.益氣活血方可顯著改善大鼠肝纖維化程度,同時(shí)下調(diào)α-SMA的表達(dá)。3.益氣活血方可以通過(guò)影響MST1/MST2的表達(dá),上調(diào)LATS1/LATS2的表達(dá),使磷酸化的YAP1增加,活化的YAP1下調(diào),最終抑制YAP/TAZ下游靶基因CTGF的表達(dá),抑制Hippo-YAP1通路,實(shí)現(xiàn)阻止纖維化進(jìn)展的作用。其中,YAP1蛋白的調(diào)節(jié)可能是由一種轉(zhuǎn)錄后機(jī)制所調(diào)控,MST1和MST2的作用機(jī)制還有待研究。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

兩兩比較的q檢驗(yàn)分析各組間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果1.肝組織病理學(xué)觀察和肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的改變：1.1HE 和 Masson 染色結(jié)果大鼠肝組織HE和Masson染色結(jié)果：對(duì)照組肝組織可見(jiàn)由終末小靜脈向外呈放射狀排列的肝細(xì)胞索。肝竇含有紅細(xì)胞，肝小葉結(jié)構(gòu)正常。未見(jiàn)纖維纖維間隔；CCL模型組大鼠中央小靜脈和匯管區(qū)的橋隔進(jìn)一步分裂假小葉，較小結(jié)節(jié)數(shù)量小于50％或大于50％，大鼠肝纖維化評(píng)分在S5-S6（大鼠纖維化診斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)與方法2.23）。益氣活血方干預(yù)組多條中央小靜脈間纖維間隔不完全包繞肝小葉，分裂肝小葉,評(píng)分為S3-S4。纖維化程度明顯降低。

1.2肝纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化組與其他兩組相比α-SMA的表達(dá)量明顯升高(見(jiàn)圖2)，三組大鼠肝臟α-SMA蛋白表達(dá)相對(duì)值（目的條帶灰度值/內(nèi)參灰度值）為0.144±0.040,0.585±0.013,0.354±0.024。益氣活血方干預(yù)組與模型組相比可明顯下調(diào)α-SMA的表達(dá)（P＜0.001）。圖 2：Wertern blotting 技術(shù)檢測(cè)正常組和模型組以及益氣活血方干預(yù)組αSMA 的蛋白表達(dá)量（a-b）。代表***p＜0.001Fig.2: protein expression of SMAin normal group, model group and YQHXintervention group was detected by Wertern blotting technique.***p＜0.0012.Hippo-YAP1通路關(guān)鍵基因蛋白及mRNA表達(dá)水平的變化2.1 肝組織Hippo通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)水平：對(duì)照組、模型組和益氣活血組大鼠肝臟YAP1蛋白表達(dá)相對(duì)值（目的條帶灰度值/內(nèi)參灰度值）分別為（0.117±0.012,0.541±0.128,0.190±0.046），模型組大鼠YAP1水平顯著增高（P＜0.05），磷酸化YAP1蛋白表達(dá)相對(duì)值分別為0.632±0.033，0.257±0.015,0.551±0.035，MST2蛋白表達(dá)相對(duì)值分別為0.372±0.042,0.197±0.027,0.488±0.080，磷酸化YAP1及上游關(guān)鍵因子MST2蛋白表達(dá)水平顯著降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。MST1蛋白表達(dá)相對(duì)值分別為0.550±0.009,0.613±0.115,0.599±0.054

及上游關(guān)鍵因子MST2蛋白表達(dá)水平顯著降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。MST1蛋白表達(dá)相對(duì)值分別為0.550±0.009,0.613±0.115,0.599±0.054，三組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖3）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 范慧寧;陳尼維;;肝纖維化的流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];國(guó)際消化病雜志;2014年01期

本文編號(hào)：2822305