原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是嚴(yán)重影響人類健康的惡性腫瘤之一,發(fā)病率全球第五,腫瘤相關(guān)死亡率位于世界第三位,早期臨床治療常以手術(shù)切除為主,不能手術(shù)切除者,常采用經(jīng)肝動脈插管栓塞化療(TACE)。由于肝癌的早期臨床癥狀不典型,診斷率低,且肝癌細胞侵襲力強,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高,往往患者的預(yù)后較差。中草藥南蛇藤(Celastrus orbiculstus Thunb.),是衛(wèi)矛科(Celastraceae)南蛇藤屬(Celastrus L.)植物,作為我國重要的藥用植物,藥典上記載其有活血、解毒、祛風(fēng)、消腫等功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),南蛇藤乙酸乙酷提取物(Celastrbiculatus extracts,COE)能顯著抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR),屬于磷脂憸肌醇激酶相關(guān)激酶蛋白家族成員,在細胞增殖、遷移和血管生成等方面有著中心調(diào)節(jié)作用。與正常組織相比,肝癌細胞中mTOR的表達水平明顯增加,可作為肝癌治療潛在的生物學(xué)靶點之一。為了深入探索南蛇藤提取物靶向mTOR治療肝癌的作用,本研究利用RNAi技術(shù),構(gòu)建了消減表達mTOR的人肝癌HepG2細胞(記作:HepG2/mTOR-),并通過體內(nèi)外研究,初步闡明了南蛇藤提取物對抑制肝癌的作用及分子機制。本研究內(nèi)容分以下四個部分。第一部分構(gòu)建人肝癌HepG2/mTOR-細胞株目的:構(gòu)建穩(wěn)定消減表達mTOR蛋白的人肝癌HepG2細胞株。方法:體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞株至對數(shù)期,將GV248-mTOR RNAi慢病毒感染人肝癌HepG2細胞,設(shè)空載體對照組及野生型細胞對照組。24 h后,倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化以及熒光表達情況。并分別提取細胞總蛋白和總RNA,分別利用Western blot方法和RT-qPCR法檢測人肝癌HepG2細胞中mTOR蛋白和RNA的相對表達情況。結(jié)果:慢病毒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細胞24 h后,熒光顯微鏡下可見,野生對照細胞貼壁良好,多為梭狀,折光性良好,細胞邊緣清晰,核質(zhì)均勻。與之相比,HepG2/mTOR-細胞形態(tài)未見明顯變化,少數(shù)細胞變細長。HepG2/mTOR-細胞中GFP熒光表達強,占總細胞數(shù)目90%左右,感染效率高。RT-qPCR及Western blot檢測結(jié)果顯示,與野生組細胞相比,HepG2/mTOR-細胞中mTOR的RNA及蛋白的表達水平明顯降低(P0.05)。結(jié)論:穩(wěn)定消減表達mTOR的人肝癌HepG2細胞株構(gòu)建成功。第二部分南蛇藤提取物對人肝癌HepG2/mTOR-細胞的影響目的:研究南蛇藤提取物(Celestrus Orbiculatus extracts,COE)對人肝癌HepG2/mTOR-細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的影響。方法:取對數(shù)期生長的人肝癌HepG2/mTOR-細胞,加入不同濃度的COE(20,40,80,160,320mg/L),以不加藥組細胞為對照,順鉑(DDP2mg/L)為陽性對照,MTT法檢測各組藥物對人肝癌HepG2/mTOR-細胞增殖能力的影響,并計算出IC50值;透射電鏡觀察藥物處理后細胞的超微結(jié)構(gòu);利用流式細胞術(shù)檢測COE對人肝癌HepG2/mTOR-細胞凋亡的影響;通過Transwell實驗觀察藥物對細胞侵襲遷移的變化。結(jié)果:與野生型細胞比較,HepG2/mTOR-組細胞的增殖、侵襲及遷移能力減弱,促進增加。與未加藥組相比,COE能促進HepG2/mTOR-細胞發(fā)生凋亡,抑制細胞的增殖、侵襲和遷移,并呈一定的濃度依賴性(P0.05)。結(jié)論:mTOR的表達與肝瘤細胞惡性程度正相關(guān)。COE能抑制人肝癌HepG2/mTOR-細胞的增殖、遷移和侵襲,并促進肝瘤細胞的凋亡。第三部分南蛇藤提取物促進人肝癌HepG2/mTOR-凋亡的分子機制目的:研究南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatus exexact,COE)對肝癌HepG2/mTOR-細胞凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/AKT相關(guān)信號通路的影響,并初步研究其可能分子機制。方法:取對數(shù)期生長的人肝癌HepG2/mTOR-細胞,依據(jù)IC50的結(jié)果,排除藥物的細胞毒性作用干擾,加入不同濃度COE(40,80,120 mg/L),同時設(shè)立野生對照組、不加藥對照組和陽性藥物對照組(DDP 2 mg/L)。藥物作用24 h后,提取總蛋白,利用Western blot法檢測各組目的蛋白的表達量。結(jié)果:COE能下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達,同時上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達,并具有濃度依賴性。COE抑制人肝癌HepG2/mTOR-細胞中mTOR信號通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-AKT、p-P70和P70、p-4E-BPl和4E-BPI的表達,并具有濃度依賴性(P0.05)。結(jié)論:COE促進人肝癌HepG2/mTOR-細胞發(fā)生凋亡,其作用機制與激活Bcl-2家族介導(dǎo)的信號通路有關(guān),也可能同時激活PI3K/AKT相關(guān)信號通路有關(guān)。第四部分南蛇藤提取物抑制肝癌的體內(nèi)研究目的:探討南蛇藤提取物(Celastrus Orbiculatusextracts,COE)對裸鼠皮下移植瘤生長的影響。方法:將HepG2/mTOR-細胞用0.9%生理鹽水懸浮密度至1×1O7個/mL,取200μL接種于裸鼠右側(cè)皮下。待裸鼠皮下成瘤后,將裸鼠隨機分為6組,每組6只,分別設(shè)對照組、COE低、中、高劑量組(10,20,40mg/kg)、陽性藥物組(斑蝥膠囊195mg/kg,替吉奧1Omg/kg)。每日灌胃,每三日測量鼠重、瘤徑,28天后頸椎脫臼法處死裸鼠,剝離皮下移植瘤并拍照,稱量瘤重,并使用免疫組化方法檢測實體瘤中相關(guān)蛋白表達。結(jié)果:COE顯著抑制裸鼠皮下移植瘤的生長,并在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。免疫組化結(jié)果表明,COE能夠下調(diào)裸鼠皮下移植瘤內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bc1-2的表達,同時上調(diào)Bax、Caspase-3 的表達(P0.05)。結(jié)論:COE能夠在體內(nèi)抑制肝癌的生長。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

３．１人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ？細胞株的成功建立逡逑利用慢病毒載體，將ＧＶ２４８－ｍＴＯＲＲＮＡｉ－ＥＧＦＰ轉(zhuǎn)染至肝癌ＨｅｐＧ２細胞中，并設(shè)立逡逑野生型細胞對照組及空載體陽性對照組，轉(zhuǎn)染４８ｈ后，結(jié)果如圖１－１所示，倒置熒光顯微逡逑鏡下觀察，野生型細胞組和空載體陽性對照組細胞狀態(tài)良好，細胞清晰，多為梭狀形結(jié)構(gòu)，逡逑細胞邊緣光滑無突起，核質(zhì)均勻。與野生型細胞形態(tài)相比，大部分ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ；細胞形逡逑態(tài)無顯著差異，ＧＦＰ熒光表達強，感染效率約９０％。逡逑Ｂｒｉｇｈｔ－ｆｉｃｌｄ邋Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邐Ｍｅｒｇｅ逡逑＿＿邋■畫逡逑圖１－１熒光顯微鏡下觀察ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ＿細胞的熒光表達（１０0ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋ｔｈｅ邋ｇｒｅｅｎ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｃｌｅａｒｌｙ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋ｉｎ逡逑ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ－邋ｃｅｌｌｓ邋（１０0ｘ）．逡逑

邐ＣＯＥ（１２０ｍｇ／Ｌ）邐ＤＤＰ（２ｍｇ／Ｌ）逡逑圖２－２邋ＣＯＥ對人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ＿細胞超微結(jié)構(gòu)的影響逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２．邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＣＯＥ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｉｎ邋ＨｅｐＧ２／邋ｍＴＯＲ＇邋ｃｅｌｌｓ逡逑ｂｙ邋ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．逡逑３．３南蛇藤提取物促進人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒｚ細胞調(diào)亡逡逑Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ－ＰＥ染料與磷酯酰絲氨酸親和力較強，能夠結(jié)合早期凋亡的細胞外側(cè)暴露的逡逑磷酯酰絲氨酸，７－ＡＡＤ染料是一種核酸染料，不可通過正常的細胞包膜，但是細胞發(fā)生凋逡逑亡時的細胞包膜發(fā)生破壞時，通透性增加，７－ＡＡＤ染料即可結(jié)合ＤＮＡ的有控降解。用流逡逑式細胞儀檢測結(jié)果如圖２－３所示，左下象限表示正常細胞，右下象限表示早期凋亡細胞，逡逑右上象限為晚期凋亡細胞。左上象限為死亡細胞及細胞碎片。ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ＿細胞組與野逡逑生組細胞對比未見明顯差異（Ｐ＞0．0５）。但隨著ＣＯＥ濃度的增高，ＨｅｐＧ２／ｍＴ０Ｒ？細胞凋逡逑亡率逐漸上升，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性（Ｐ＜０．０５）。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，ＣＯＥ呈濃逡逑度依賴性的促進人肝癌ＨｅｐＧ２／ｍＴＯＲ？細胞發(fā)生凋亡。逡逑

ｉ６0－邋ｔ邋ＩＩＩ邋ｔ＼Ｍ＾＼邋ＳＬ逡逑ｉＩｄＪＩｌｉｌｉ逡逑Ｐ１３Ｋ邋Ｐ－ＰＩ３Ｋ邐ＡＫＴ邐Ｐ－ＡＫＴ逡逑圖３－３邋ＣＯＥ對ｍＴＯＲ上游相關(guān)蛋白的影響逡逑Ｆｉｇｕｒｅ３－３．邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＣＯＥ邋ｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＰＩ３Ｋ，邋ｐ－ＰＩ３Ｋ，邋ＡＫＴ，逡逑ｐ－ＡＫＴ逡逑

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6 韓才m

本文編號：2821271