一口鐘是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬植物中藍桉(Eucalyptus globulus Labill.)的成熟干燥果實,果形猶如倒掛的小鐘而得名。一口鐘是我國傳統(tǒng)的民間中草藥,主產(chǎn)于西南地區(qū),具有抑菌消炎、補脾健胃、通絡祛風利濕等功效。截至目前為止,文獻報道一口鐘包含的化學成分有單萜、倍半萜、間苯三酚類、黃酮類、三萜類及鞣花酸類等。前期研究發(fā)現(xiàn)一口鐘甲醇提取物能抑制小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 NO和TNF-α的產(chǎn)生,還對類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocyte,FLS)的增殖與TNF-α的分泌有抑制作用,本文以探索中藥中結構新穎、抗炎作用突出的活性化合物為目的,選取了一口鐘為對象進行研究:(1)對一口鐘進行化學成分的分離與鑒定;(2)對所得化合物進行抗炎和抗類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)活性篩選。本文以95%乙醇作為提取溶劑、以石油醚等有機溶劑作為萃取劑,依次得到石油醚、醋酸乙酯和水層萃取物,之后以硅膠柱色譜、凝膠滲透色譜和半制備高效液相色譜(Semi-high performance liquid chromatography,HPLC)等色譜分離技術分離純化樣品,先后從一口鐘95%乙醇提取物的石油醚層萃取部位得到27個化合物,通過質譜(Mass spectrometry,MS)、一維和二維核磁共振波譜(1D,2D-Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)等技術,解析鑒定出每個化合物的結構,分別為:globulol A(1),globulol B(2),globulol C(3),eucalyptal A(4),eucalyptone(5),euglobal-Ia1(6),euglobal-Ia2(7),euglobal-Ⅲ(8),macrocarpal A(9),macrocarpal B(10),macrocarpal C(11),macrocarpal D(12),macrocarpal E(13),macrocarpal P(14),macrocarpal Q(15),1,10-dioxotayloriane(16),litseagermacrane(17),藍桉醇(18),表藍桉醇(19),綠花白千層醇(20),齊墩果酸(21),白樺脂酸(22),熊果酸(23),11α-甲氧基熊果酸(24),1-(2,6-dihydroxy-4-methory-3,5-dimethylphenyl)-2-methylbutan-1-one(25),鞣花酸(26),3-甲氧基鞣花酸-4'-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(27)。其中化合物1~3為未見文獻報道的新化合物,化合物16和17為首次從桉屬植物中分離得到,化合物14、15、24和25為首次從藍桉植物分離得到,化合物5、6、7、8、11、12和13為首次從藍桉的果實中分離得到。本文選用小鼠單核巨噬細胞RAW264.7為細胞模型,對部分化合物進行了抗NO釋放活性和TNF-α抑制分泌活性的篩選。在低細胞毒劑量下,利用Griess法,考察化合物對脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激RAW264.7細胞釋放NO的抑制作用。結果表明,化合物9、13、15和19在1μg/mL時有較強的抑制活性,抑制率分別為:20.39%、12.25%、15.07%和12.66%;以酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢驗化合物對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNF-α的抑制活性,化合物9、10、15、18、19、20、22和25在1μg/m L濃度下顯示出較強的抑制活性,抑制率分別為:27.30%、31.58%、27.70%、23.73%、30.08%、36.46%、31.39%和21.21%。本文以類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)為細胞模型,進行細胞增殖抑制實驗和抑制TNF-α生成實驗的研究,結果顯示化合物2、5、9、10、13和22在5μg/mL時能干擾FLS細胞的正常生長,FLS細胞生長抑制率分別為:73.91%、33.78%、37.50%、25.40%、34.23%和67.21%;在篩選化合物對于TNF-α生成的抑制活性時,采用抗原抗體反應結合酶聯(lián)免疫的方法進行測試,結果顯示化合物2、5、9、10、11和13在1μg/mL時對TNF-α生成的抑制率分別為44.56%、59.31%、25.43%、29.66%、55.09%和54.72%,表現(xiàn)出一定的抑制作用。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R284.1
【部分圖文】：

類型規(guī)格 流動相相柱YMC-Pack ODS-A SH-343-520 mm×250 mmAA12S05-2520WTNo.2025001996 (W)MeOH-H2O 一口鐘提取分離過程1 一口鐘樣品的粗提物分離一口鐘藥材（干重 20 kg）粉碎，95%乙醇浸漬，每次浸漬 3 天，，將浸漬液合并后減壓濃縮，得到乙醇提取物的浸膏(2992 g)。乙次經(jīng)過石油醚、醋酸乙酯和水萃取 3 次，分別得到不同有機溶劑層合并相同溶劑的萃取物進行減壓濃縮，最終得到石油醚萃取物(1592萃取物(406 g)和水層萃取物。石油醚層萃取物 800 g，經(jīng)硅膠柱色譜初步分離，流動相選擇石油酯(60:1, 30:1, 15:1, 8:1, 4:1, 2:1, 1:1)梯度洗脫，得到Y0101-Y0116，共具體分離過程見圖 1.1。

醫(yī)科大學碩士學位論文 一、中藥一口鐘化學成分的提取分離與鑒石油醚、乙酸乙酯、水萃取 3 次，合并萃取液，減壓濃縮硅膠柱色譜，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脫.2 一口鐘樣品的系統(tǒng)分離Y0114 (59 g)組分，進行硅膠(200-300 目)柱分離，流動相是二氯甲烷：甲醇(CH2Cl2:MeOH:CH3COOH = 80:1:1)，得到 14 個組分，其中 0204 和 0207 化合物 9 (26.0 mg)，10 (42.5 mg)。Y0203 (9 g)通過半制備高效液相色C)反相柱分離，以甲醇：水(MeOH:H2O = 90:10)和 5‰冰乙酸(5‰CH3COO動相，得到化合物 1 (4.5 mg)，12 (5.2 mg)，13 (34.8 mg)。Y0205 和Y02合并后，經(jīng)半制備高效液相色譜反相柱分離，以MeOH:H2O = 90:10H3COOH為流動相，得到化合物 17 (4.2 mg)，組分Y1208 和Y1219 分別用HPLC純化，依次得到化合3 (4.6 mg)，4 (35.8 mg)，5 (264.3 mg)，14 (11.5 mg2.6 mg)，16 (2.7 mg)，27 (5.0 mg)。具體分離過程見圖 1.2 所示。

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 一、中藥一口鐘化學成分的提取分離與鑒定組分Y0115 經(jīng)Toyopearl HW-40 凝膠柱色譜分離，流動相為二氯甲烷：甲醇(CH2Cl2:MeOH = 2:1)，得到 6 個組分，其中組分Y0301 經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯：乙酸(P.E.:CH2Cl2:EtOAc:CH3COOH = 80:60:2:2)作為流動相進行分離，得到化合物 6 (27.5 mg)，7 (17.4 mg)，8 (5.3 mg)。組分Y0302經(jīng)半制備HPLC (ODS-A, MeOH:H2O = 88:12, 5‰CH3COOH)分離，得到化合物 2(23 mg)。組分Y0303 經(jīng)半制備HPLC (ODS-A, MeOH:H2O = 93:7, 5‰CH3COOH)分離，分別得到化合物 11 (6.7 mg)，18 (22.1 mg)，21 (24 mg)，23 (19.1 mg)。組分Y0304 通過半制備HPLC (ODS-A, MeOH:H2O = 88:12, 5‰CH3COOH)純化分離，依次得到化合物 19 (4.3 mg)，26 (13.3 mg)。組分Y0305 經(jīng)過半制備HPLC(ODS-A, MeOH:H2O = 90:10, 5‰CH3COOH)純化分離，得到化合物 20 (82.4 mg)，22 (10.5 mg)，24 (15.2 mg)，25 (3.3 mg)。分離流程如圖 1.3 所示。

【參考文獻】

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本文編號：2820789