目的大黃治療慢性腎衰竭(CRF)的療效肯定,有生、熟、酒、炭四種炮制品。本研究旨在測定不同炮制和煎煮時間大黃的有效成分變化規(guī)律,建立CRF大鼠模型,通過不同炮制方法和煎煮時間的大黃水煎液灌胃治療CRF大鼠,觀察CRF大鼠腎功能改善情況,找出治療CRF大鼠的最佳炮制方法及煎煮時間點,并探討大黃治療CRF的作用機理,為合理使用大黃治療CRF提供理論依據(jù)。方法實驗一:生大黃、熟大黃、酒大黃、大黃炭四種炮制品采用后下的方式,分別煎煮5,7,9,10,15,20,30分鐘,制成濃度為1g/ml的大黃水煎液各50ml。四種大黃,每種7個不同煎煮時間點的樣品。采用高效液相色譜法測定28種大黃水煎液中沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚主要成分含量,并行線性關(guān)系考察,精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗。實驗二:將160只SD大鼠隨機選取10只作為正常對照組,其余150只隨機分籠飼養(yǎng),采用灌胃腺嘌呤溶液的方法制備慢性腎衰大鼠模型,濃度為2.5%,按200 mg·kg~(-1)·d~(-1),造模周期28天。觀察模型大鼠的體重,腎功能,解剖病理結(jié)構(gòu),由此得到能真實模擬CRF疾病與癥狀表現(xiàn),且死亡率低,具有較好重復(fù)性的CRF的造模方法,為后期實驗提供依據(jù)。實驗三:將145只CRF大鼠隨機分為模型組,大黃水煎液治療組(每種大黃炮制品后下分別煎煮5、7、9、10、15、20、30min),正常對照組,每組5只大鼠,共30組。正常組正常飼料喂養(yǎng),模型組給予等劑量的大黃治療組生理鹽水灌胃,28組大黃治療組,每日給相應(yīng)的大黃水煎液灌胃,共治療8周。檢測治療后各組大鼠血BUN、血Cr、血UA值,觀察改善腎功能的情況。實驗四:采用實驗三方法,治療觀察實驗大鼠一周時,四周時的首次瀉下時間、5h內(nèi)瀉下次數(shù)和總排便次數(shù),比較瀉下作用,測定大鼠的結(jié)腸組織的ATP酶活力,比較治療一周和四周時的各組大鼠腎功能指標(biāo),分析腎功能與瀉下的關(guān)系。實驗五:將80只CRF大鼠隨機分為模型組,熟大黃水煎液治療組(熟大黃后下分別煎煮5、7、9、10、15、20、30min),正常對照組,每組10只大鼠,共9組。正常組正常飼料喂養(yǎng),模型組給予等劑量的熟大黃治療組生理鹽水灌胃,7組熟大黃治療組,每日給相應(yīng)的熟大黃水煎液灌胃,治療8周。摘取腎臟,觀察形態(tài),右腎組織制備石蠟切片,左腎組織-80℃冰箱保存。制備大鼠腎臟病理切片,觀察各組腎臟病理學(xué)改變,觀察腎臟細(xì)胞凋亡情況。實驗六:選取實驗五各組大鼠腎組織石蠟切片,免疫組化法檢測腎組織LN、ColⅣ、α-SMA、p-PI3k、PI3k、p-Akt、Akt、TGF-β1蛋白的表達(dá)。實驗七:選取實驗五各組大鼠新鮮冰凍腎組織,RT-PCR技術(shù)檢測腎組織AQP1mRNA、AQP2mRNA、TGF-β1mRNA的表達(dá)水平。實驗八:選取實驗五各組大鼠新鮮冰凍腎組織,Western-blot技術(shù)檢測熟大黃組對CRF大鼠LN、ColⅣ、α-SMA、p-PI3k、PI3k、p-Akt、Akt、TGF-β1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果(1)實驗一,28種大黃水煎液中沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量線性關(guān)系、穩(wěn)定性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率良好。4中炮制品隨煎煮時間增加,除熟大黃之外,主要成分的含量均呈遞增的趨勢。熟大黃主要成分含量在10分鐘左右達(dá)到最大值,蒽醌類主要成分在不同炮制品中總含量依次為生大黃熟大黃酒大黃大黃炭。(2)實驗二,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實驗結(jié)果選用灌胃腺嘌呤溶液的方法制備CRF模型,可真實模擬CRF疾病與癥狀表現(xiàn),且死亡率低,具有較好重復(fù)性。(3)實驗三結(jié)果顯示,治療8周后,在生大黃、熟大黃、酒大黃、大黃炭組中,與模型組相比,血Cr、血BUN、血UA值顯著降低(P0.01),其中生大黃9分鐘降低最明顯(P0.05),熟大黃、大黃炭10分鐘降低最明顯(P0.05),酒大黃15分鐘降低最明顯(P0.05);在四種大黃炮制組中,其中熟大黃組降低最明顯(P0.05)。(4)實驗四結(jié)果顯示,治療一周時,與正常組、模型組比較,大黃治療組均有瀉下作用(P0.01);生大黃10分鐘組的瀉下作用最明顯(P0.05);大黃治療組血Cr、血BUN、血UA值顯著降低(P0.01);其中生大黃組降低最明顯(P0.05)。治療四周時,每組大黃瀉下作用均不明顯,幾乎沒有瀉下作用,無法統(tǒng)計。四種大黃炮制組中,與模型組相比,大黃治療組血Cr、血BUN、血UA值顯著降低(P0.01);其中熟大黃組降低最明顯,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)各組大黃炮制品治療組與正常組比較,均對大鼠結(jié)腸Na+-K+-ATP酶的活性有抑制作用(P0.01),其中生大黃組抑制作用最明顯(P0.05)。(5)實驗五結(jié)果顯示,與模型組相比,熟大黃治療組腎小球系膜/小球面積比值顯著降低(P0.01),其中熟大黃10分鐘降低最明顯(P0.05);熟大黃治療組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P0.01),其中熟大黃10分鐘降低最明顯(P0.05)。(6)實驗六結(jié)果顯示,模型組大鼠腎組織的LN、ColⅣ、α-SMA、TGF-β1、p-PI3k、PI3k、p-Akt、Akt平均光密度顯著高于正常組(P0.01);而與模型組相比,熟大黃治療組平均光密度比值顯著降低(P0.01),其中熟大黃10分鐘組降低最明顯(P0.05)(7)實驗七結(jié)果顯示,正常組中AQP1mRNA、AQP2mRNA表達(dá),較模型組比較明顯增強(P㩳0.01),其中熟大黃10分鐘組增強最明顯。模型組大鼠腎組織的TGF-β1mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P0.01);而與模型組相比,熟大黃治療組表達(dá)量顯著降低(P0.01)。其中熟大黃10分鐘組降低最明顯(P0.05)。(8)實驗八結(jié)果顯示,模型組大鼠腎組織的PI3k、Akt、LN、ColⅣ、α-SMA、TGF-β1平均灰度比值顯著高于正常組(P0.01);而與模型組相比,熟大黃治療組平均灰度比值顯著降低(P0.01),其中熟大黃10分鐘降低最明顯(P0.05)。模型組大鼠腎組織的p-PI3k、p-Akt平均灰度比值顯著低于正常組(P0.01);而與模型組相比,熟大黃治療組平均灰度比值顯著增高(P0.01),其中熟大黃10分鐘增高最明顯(P0.05)。結(jié)論(1)高效液相色譜法測定各大黃水煎液成分穩(wěn)定精確,蒽醌類主要成分在不同炮制品中總含量依次為生大黃熟大黃酒大黃大黃炭,熟大黃主要成分在10分鐘左右含量達(dá)到最大值。(2)CRF模型的建立,以濃度為2.5%,按200mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃腺嘌呤溶液的方法制備CRF大鼠模型,最為穩(wěn)定,死亡率低。(3)熟大黃后下煎煮10分鐘組,對CRF大鼠腎功能改善最明顯,熟大黃后下煎煮10分鐘治療CRF大鼠療效最佳,優(yōu)于其它煎煮時間的炮制品。(4)大黃治療CRF的機理與其瀉下作用有一定關(guān)系,生大黃瀉下作用強于其它炮制大黃,生大黃在早期腎功能指標(biāo)的恢復(fù)中有一定的優(yōu)勢,在后期治療中以熟大黃為優(yōu)。(5)熟大黃治療CRF大鼠,通過抑制腎小球系膜增生,抑制細(xì)胞凋亡,減輕腎小球硬化程度,延緩CRF進(jìn)程。(6)熟大黃治療CRF大鼠,通過對AQP1、AQP2的調(diào)節(jié),減少水分的滯留及毒素的蓄積,同時通過對TGF-β1mRNA的抑制作用,減輕腎小球硬化的程度,從而延緩腎功能的進(jìn)展。(7)熟大黃治療CRF大鼠,可能通過抑制p-PI3k、p-Akt,從而抑制TGF-β1/PI3k/Akt通路,達(dá)到減輕CRF大鼠腎組織纖維化的作用。(8)通過上述7點,我們認(rèn)為,大黃能有效改善CRF大鼠腎功能及腎臟纖維化。在大黃炮制品中,后下煎煮時間10min左右的熟大黃更適用于CRF大鼠的治療。我們探討了其可能的作用機制,為大黃更好的治療CRF提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆博士學(xué)位論文造模后兩組血清肌酐、尿素氮和尿酸水平的比較（ x±s，n=10體重 血 CR 血 BUN 血 UA350.12±12.56 86.09±5.26 5.20±1.22 132.08±20.300.52±9.25*122.20±18.36*8.27±2.56*241.51±32.1對照組比較，*P<0.01。剖形態(tài)學(xué)比較物實驗結(jié)束時，用 10%水合氯醛麻醉 SD 大鼠。測量腎臟的外觀，腎臟的組織病理學(xué)變化。結(jié)果顯示，正常對照，紅褐色，表面光滑，形態(tài)正常，切面觀察腎皮髓質(zhì)分RF 大鼠腎臟肥大，面色蒼白，表面凹凸不平，表現(xiàn)為質(zhì)與髓質(zhì)之間的界限不明顯。見圖 4。

湖北中醫(yī)藥大學(xué) 2019 屆博士學(xué)位論文 腎組織一般觀察正常組腎臟蠶豆樣，紅褐色，質(zhì)地堅硬，大小正常，無腫脹，有光態(tài)規(guī)則。剖開后，可見皮膚和髓質(zhì)之間的邊界清晰，皮質(zhì)顏色為紅棕質(zhì)顏色為淺紅色，腎包膜緊密結(jié)合，不易剝落。其它組的腎臟大小有程度的增加，尤其是模型組，這在各組腎臟中最明顯，是正常大鼠的。模型組，腎臟顏色蒼白，表面凹凸不平，呈現(xiàn)出“大白腎”的變化。大黃治療組中，腎臟大小介于正常組和模型組之間，顏色為暗紅色在腎臟表面上觀察到少量白色顆粒。腎包膜與組織黏連，可見皮質(zhì)和之間的邊界。見圖 14。果

各組腎臟病理變PAS染色比較（×400）

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本文編號：2819905