研究背景增生性瘢痕(hypertrophic scars,HS)臨床治療手段主要有手術(shù)切除和藥物治療。手術(shù)治療費用較高,且復(fù)發(fā)率高,而目前主要應(yīng)用于臨床抑制HS的藥物,毒副作用大、復(fù)發(fā)率高。因此,研制出有效治療防治瘢痕增生的藥物是該領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。貝伐單抗(Bevacizmnab,BEV)能特異性阻斷VEGF的生物效應(yīng),抑制增生性瘢痕血管過度增生,抑制成纖維細(xì)胞(Fb)生長和轉(zhuǎn)移,從而抑制瘢痕增生。丹皮酚能抑制轉(zhuǎn)換因子-β_1(TGF-β_1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生,能有效抑制微血管過度增殖。本課題擬將貝伐單抗通過聚乙二醇與磷脂相連,制備抗體修飾脂質(zhì)體包裹丹皮酚,增強(qiáng)藥物在真皮層的滯留量,阻斷VEGF的生物效應(yīng),達(dá)到預(yù)防瘢痕增生的目的。目的研制丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑,優(yōu)化處方和制備工藝,考察其體外透皮性能及真皮滯效應(yīng),并進(jìn)行丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑皮膚刺激性及抑瘢效果考察。方法(1)BEV-PEG_(3000)-DOPE抗體偶聯(lián)物合成。包括Pnp-PEG_(3000)-DOPE合成,MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定;采用乙醇注入法合成BEV-PEG_(3000)-DOPE,Sephadex G-150凝膠柱法測定偶聯(lián)率,GPC測定BEV-PEG_(3000)-DOPE分子量,IR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。(2)丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體的制備及其質(zhì)量考察。采用薄膜分散-超聲法制備丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體,以包封率為評價指標(biāo),單因素試驗篩選出顯著因素,Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體的制備工藝,透射電鏡觀察脂質(zhì)體形態(tài),激光粒度儀測定粒徑及Zeta電位。制備丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑。(3)丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑的質(zhì)量考察�？疾斓てし覸EGF抗體修飾脂質(zhì)體的質(zhì)量性質(zhì),包括性狀、粘度、pH值、離心試驗及含量測定。進(jìn)行真皮滯留量的考察,比較丹皮酚VEGF抗體脂質(zhì)體透皮制劑、丹皮酚脂質(zhì)體凝膠及丹皮酚凝膠中丹皮酚的真皮滯留量及透皮速率,并繪制體外滲透曲線。采用左右對比法進(jìn)行皮膚刺激性考察,觀察皮膚有無紅斑及水腫現(xiàn)象,同時將給藥部位的皮膚HE染色。(4)將兔子隨機(jī)分為模型組、空白組、陽性藥物組、丹皮酚凝膠組(Pae-Gel)、丹皮酚脂質(zhì)體凝膠組(Pae-Lip-Gel)與丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑組(Bev-Pae-Lip-Gel),建立兔耳增生性瘢痕模型,計算各組瘢痕增生率,測量各組瘢痕增生指數(shù)(SEI),光鏡下觀察HE染色與Masson染色后組織增生情況,雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗法(ELISA)檢測各組VEGF、TGF-β_1與TNF-α表達(dá)水平。結(jié)果(1)成功合成Pnp-PEG_(3000)-DOPE,分子量為4090;成功合成BEV-PEG_(3000)-DOPE,偶聯(lián)率為63.72%,分子量為226570,IR測得所需官能團(tuán)。(2)丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體最優(yōu)制備工藝為:卵磷脂:膽固醇:丹皮酚:Pnp-PEG_(3000)-DOPE:BEV-PEG_(3000)-DOPE為14:5:4:0.28:0.05,磷脂濃度7.36mg·mL~(-1),成膜溫度為41℃,pH 7.5的磷酸二氫鈉緩沖溶液脫膜,超聲3 min(超聲時間2 s,間隔3 s,功率300 W);包封率(73.61±2.36)%,平均粒徑(235.7±4.67)nm,Zeta電位-(5.13±0.25)mV。(3)丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑粘度在6.6~7.4 Pa·S之間,pH值在7.0~7.5之間,含量為2.193±0.3107 mg·g~(-1);丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑透皮速率緩慢,真皮滯留效果顯著。丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體凝膠無刺激性。(4)丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑組的瘢痕增生率為47.92%,低于其他各組;SEI為1.34±0.51,VEGF為30.90±3.57 ng·L~(-1),TGF-β_1為733.2±43.19ng·L~(-1),TNF-α為66.76±2.98 ng·L~(-1),與模型組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與模型組比,丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體凝膠組膠原纖維細(xì)胞與肌纖維細(xì)胞較少,排列疏松,軟骨細(xì)胞排列較規(guī)則,鈣化不嚴(yán)重,炎癥細(xì)胞較少。結(jié)論乙醇注入法適于制備BEV-PEG_(3000)-DOPE,Box-Behnken效應(yīng)面法可用于優(yōu)化丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑制備工藝,丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑具有緩釋作用,真皮滯留量顯著;丹皮酚VEGF抗體修飾脂質(zhì)體透皮制劑對家兔皮膚無刺激性且對兔耳增生性瘢痕有良好的治療效果。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ460.6;R285
【部分圖文】：

圖 1-1 瘢痕形成機(jī)制圖Fig.1-1 The mechanisms of hypertrophic scar1.2治療手段1.2.1壓力療法加壓治療主要是壓力可以調(diào)節(jié)ECM中膠原含量，使之達(dá)到合成分解的平衡，并促使螺旋狀膠原束恢復(fù)彈性，達(dá)到平行排列的狀態(tài)[17]。已經(jīng)有研究證實，加壓治療不僅可以改善 ECM 的組織結(jié)構(gòu)，而且降低 Fb 的數(shù)量。該方法一般是在傷口愈合初期采取的治療手段，愈合 6 個月以后，治療效果明顯降低。1.2.2激光療法激光治療自上世紀(jì)中葉被用于臨床，通過激光物理特性，如燒灼、切割、散焦等作用，消除 HS 組織。這種方法可以減少 ECM 中膠原合成和 Fb 增殖，從而達(dá)到 HS 治療的目的[18]。目前脈沖染料激光、Nd:YAG 激光、點陣激光、光動力

一條可行性途徑。將BEV修飾脂質(zhì)體，明顯抑制原生代培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF表達(dá)，防止腫瘤部位的新生血管生成。VEGF 抗體修飾脂質(zhì)體工藝成熟、制備簡單，易于工業(yè)化推廣；但未見 BEV 結(jié)合脂質(zhì)體包載丹皮酚應(yīng)用于增生性瘢痕的治療。我們設(shè)想，將 BEV 修飾脂質(zhì)體表面，制備成靶向制劑，利用 BEV 的靶向作用，與 VEGF 受體相結(jié)合，將脂質(zhì)體微粒牢牢的留于真皮層，同時釋放包封藥物，實現(xiàn)藥物在瘢痕增生部位的定位滯留。我們推測，VEGF 抗體修飾脂質(zhì)體載體可望同時發(fā)揮著定位定向傳輸藥物及抑制血管增值和炎癥反應(yīng)的雙重作用。4.2創(chuàng)新點抗體修飾脂質(zhì)體由于其具備長循環(huán)鏈，可以避免貯存過程中易發(fā)生氧化、分層、泄漏等穩(wěn)定性問題發(fā)生。將 BEV 修飾脂質(zhì)體表面，制備成靶向制劑，利用 BEV 的靶向作用，與 VEGF受體相結(jié)合，將脂質(zhì)體微粒滯留于真皮層，同時釋放包封藥物，實現(xiàn)藥物在瘢痕增生部位的定位滯留，達(dá)到預(yù)防瘢痕增生的目的。

廣東藥科大學(xué)碩士研究論文方法與結(jié)果 Pnp-PEG3000-DOPE合成取 DOPE 32 μmol，加入適量三氯甲烷溶解，配置成 50 mg·mL-1溶液，胺80 μL，加入適量濃度為200 mg·mL-1PEG-(Pnp)2三氯甲烷溶液，氬氣攪拌孵育過夜。減壓蒸發(fā)，除去三氯甲烷，在 pH 為 2.0(HCl 溶液調(diào)節(jié)) 0.15 mol·L-1的 NaCl 溶液中，超聲得到 Pnp-PEG3000-DOPE 膠束，用 Seph 20 柱分離純化，三氯甲烷萃取 Pnp-PEG3000-DOPE(純度>95%)，MS 進(jìn)行定 ， 結(jié) 果 見 圖 2-1 。 結(jié) 果 表 明 合 成 物 分 子 量 為 4090 ， 與 目 標(biāo) 產(chǎn)-PEG3000-DOPE 吻合。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2818857