發(fā)布時間：2020-09-15 10:07

　　 目的:克隆遠志3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)基因與查爾酮合成酶(CHS)基因,分析其基因表達量對藥用成分含量的影響,并從酶活性的角度驗證HMGR的功能,為遠志資源的可持續(xù)利用及種質(zhì)改良提供借鑒。方法:(1)通過RT-PCR與RACE相結(jié)合的方法克隆遠志HMGR、CHS基因的全長序列,并對其進行生物信息學(xué)分析,同時對HMGR、CHS基因編碼的蛋白功能與結(jié)構(gòu)進行預(yù)測與分析。(2)利用RT-qPCR技術(shù)、紫外分光光度法、高效液相色譜法分別測定了遠志根、莖、葉不同部位HMGR基因及CHS基因表達量、遠志總皂苷及總黃酮含量、細葉遠志皂苷及遠志口山酮Ⅲ含量,并對基因表達量與藥用成分進行相關(guān)分析。(3)通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對HMGR的功能進行驗證。結(jié)果:(1)從遠志中克隆獲得HMGR、CHS基因的全序列,并分別命名為PtHMGR、PtCHS,(GenBank登錄號分別為MK424118、MK424117)。PtHMGR cDNA序列為全長2323 bp,包含一個1782 bp的完整開放閱讀框,共編碼593個氨基酸;預(yù)測PtHMGR編碼蛋白的理化性質(zhì),其分子式為C_(2781)H_(4486)N_(770)O_(853)S_(33),分子量為63414.84 Da,等電點PI為6.09。PtCHS cDNA序列為全長1634 bp,包含一個537 bp的完整開放閱讀框,共編碼178個氨基酸;預(yù)測PtCHS編碼蛋白的理化性質(zhì),其分子式為C_(895)H_(1420)N_(244)O_(251)S_(12),分子量為19999.33 Da,等電點PI為9.25。(2)遠志PtHMGR、PtCHS基因在根、莖、葉不同部位之間差異表達,其中PtHMGR基因在根部表達量最高,葉次之,莖部表達較低;PtCHS基因在莖部表達量最高,葉次之,根部最少。遠志根、莖、葉不同部位總皂苷、總黃酮、細葉遠志皂苷、遠志口山酮Ⅲ的含量也存在差異,其中總皂苷、細葉遠志皂苷、遠志口山酮Ⅲ在根部含量較高,而總黃酮主要積累于莖部。遠志PtHMGR、PtCHS基因表達量與藥用成分相關(guān)分析顯示,總皂苷及細葉遠志皂苷含量與PtHMGR基因的表達呈正相關(guān);總黃酮含量與PtCHS基因表達呈正相關(guān),而遠志口山酮Ⅲ含量與PtCHS基因表達量呈負相關(guān)。(3)HMGR經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后成功表達,并催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)生成甲瓦龍酸內(nèi)酯。結(jié)論:本研究首次從遠志中克隆獲得HMGR、CHS基因的全序列,并分析了遠志PtHMGR、PtCHS基因與藥用成分的關(guān)聯(lián)性,結(jié)果顯示總皂苷及細葉遠志皂苷含量與PtHMGR基因的表達量正相關(guān);總黃酮含量與PtCHS基因表量正相關(guān)。利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對PtHMGR的功能進行驗證,結(jié)果顯示,遠志PtHMGR具有HMGR酶的催化功能,可催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)生成甲瓦龍酸內(nèi)酯。因此可通過上調(diào)基因的表達來促進遠志藥效成分的積累,進而提高遠志藥材的質(zhì)量。
【學(xué)位單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R284.1
【部分圖文】：

28S 和 18S 條帶清晰（圖1）無明顯拖尾現(xiàn)象，說明 RNA 完整性較好[23]。OD260/OD280比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)，RNA 的 OD260/OD280讀數(shù)一般在 2.0 左右，2.0 是高質(zhì)量 RNA的標(biāo)志。通過超微量分光光度計檢測遠志總 RNA 的 OD260/OD280比值為 1.94，說明 RNA 中蛋白質(zhì)污染程度較低，純度較高，因此提取的遠志根部總 RNA 可用于后續(xù) cDNA 第一鏈的合成。圖 1 遠志總 RNA 電泳圖Fig.1 Total RNAelectropherogram of P. tenuifolia3.2 遠志 HMGR、CHS 基因核心片段序列的獲取將遠志總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 cDNA 第一鏈為模板，分別利用引物HMGR-F1、HMGR-R1 和 CHS-F1、CHS-R1

2 遠志 HMGR(a)、CHS(b)基因核心片段電泳圖 (Mhe electropherogram of intermediate fragments of HMGRMGR、CHS 基因 5′RACE 實驗得的遠志 HMGR、CHS 基因核心片段設(shè)計三條特異性1 、 HMGR-GSP2 、 HMGR-GSP3 和 CHS-GSP1 、利用引物HMGR-GSP1和CHS-GSP1將遠志總RNA反模板，利用引物HMGR-GSP2、HMGR-GSP3和CHS-GCR 擴增后，得到大小分別約為 500 bp、1000 bp 的兩

MGR(a)、CHS(b)基因 5'RACE 電泳圖 (M： electrophoretogram of HMGR and CHS genes (、CHS 基因 5'片段長度分別為 456 bp、942 bCHS 基因 3'RACE 實驗CHS 基因核心片段序列結(jié)果，設(shè)計兩條特異和CHS-1、CHS-2。將遠志總RNA反轉(zhuǎn)錄為3'，利用兩條引物進行兩輪 PCR 擴增后，得到 的條帶，如圖 4 所示。得到的遠志 HMGR、p、464 bp。

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本文編號：2818828