目的:通過收集患者四診資料及用藥處方,探討高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的中醫(yī)證候分布規(guī)律及導(dǎo)師用藥規(guī)律。從中醫(yī)角度更標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化的研究高血壓伴動(dòng)脈粥樣硬化的病機(jī)特點(diǎn),為更好的制定臨床診療方案提供參考。根據(jù)高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化臨床證候分布特點(diǎn)和用藥規(guī)律設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究部分,以氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)干預(yù)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human aortic endothelial cell,HAEC)構(gòu)建內(nèi)皮損傷模型,從長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)角度研究ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的相關(guān)機(jī)制。通過提取刺蒺藜有效成分,篩選刺蒺藜、杜仲最佳有效部位,確定二者最佳配伍比例,探討杜仲-刺蒺藜(杜仲、刺蒺藜有效組分配伍藥對(duì))改善ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制,為明確杜仲-刺蒺藜改善血管內(nèi)皮功能,緩解動(dòng)脈粥樣硬化,治療高血壓的藥理機(jī)制提供理論依據(jù),并且為杜仲-刺蒺藜藥對(duì)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支撐。方法:1.高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的中醫(yī)證候分布規(guī)律及用藥規(guī)律研究:收集110例高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的臨床資料及用藥處方,統(tǒng)計(jì)各癥狀、體征及用藥頻數(shù),使用SPSS進(jìn)行聚類分析,統(tǒng)計(jì)高血壓伴頸動(dòng)脈粥樣硬化的中醫(yī)證候分布規(guī)律及用藥規(guī)律。結(jié)合頸動(dòng)脈彩超及血脂生化,研究各證型與頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(intima-media thickness,IMT)、臂踝脈搏波傳導(dǎo)速度(brachial-ankle pulse wave velocity,baPWV)、最大斑塊面積以及血脂各指標(biāo)的相關(guān)性,分析各證型特點(diǎn)。依據(jù)現(xiàn)代數(shù)據(jù)挖掘理念和方法,解析導(dǎo)師楊傳華教授在治療高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的用藥處方規(guī)律。2.刺蒺藜有效成分的提取及杜仲、刺蒺藜有效部位的篩選:刺蒺藜經(jīng)粉碎后使用70%乙醇浸泡,加熱回流提取濾去不溶部分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,負(fù)壓下回收得粗提物,刺蒺藜有效成分使用LC-ESI-MS/MS鑒定。使用MTT法及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)篩選刺蒺藜、杜仲的有效部位,研究并明確刺蒺藜成分的有效物質(zhì)基礎(chǔ),確定刺蒺藜及杜仲最佳有效部位的配伍比例。3.ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制研究:體外培養(yǎng)HAEC,以ox-LDL誘導(dǎo)建立內(nèi)皮損傷模型,通過MTT法、流式細(xì)胞儀、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、seahorse細(xì)胞能量代謝實(shí)驗(yàn)分別觀察ox-LDL對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力以及能量代謝的影響,采用lncRNA聯(lián)合mRNA基因芯片檢測ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC中l(wèi)ncRNA的表達(dá)改變,使用生物信息學(xué)分析研究lncRNA調(diào)控ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷的機(jī)制。經(jīng)siRNA敲減代表性lncRNA(NONHSAT061051)后,驗(yàn)證其在ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷過程中的作用。4.杜仲-刺蒺藜對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究:使用杜仲、刺蒺藜有效組分配伍藥對(duì)干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷模型,通過MTT法、流式細(xì)胞儀、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、seahorse細(xì)胞能量代謝、單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)觀察杜仲-刺蒺藜對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC的增殖、凋亡、遷移能力、能量代謝以及單核-內(nèi)皮細(xì)胞黏附水平的影響,采用lncRNA聯(lián)合mRNA基因芯片檢測經(jīng)杜仲-刺蒺藜干預(yù)后lncRNA的表達(dá),同ox-LDL模型組比較,篩選差異基因,使用生物信息學(xué)分析差異基因,從lncRNA角度研究杜仲-刺蒺藜改善ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷的機(jī)制。結(jié)果:1.高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的中醫(yī)證候分布規(guī)律及用藥規(guī)律研究:110例高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的年齡為47-80歲,平均年齡69.25±10.39歲。通過聚類分析,110例患者主要分為3大類,結(jié)合臨床癥狀,共分為5類證型,肝腎陰虛證、肝陽上亢證以及痰濁中阻、瘀血阻滯、痰瘀互結(jié)證,分別占比43.64%、20.00%、15.45%、11.82%、9.09%。痰濁中阻組、肝陽上亢組頸動(dòng)脈IMT高于肝腎陰虛組(P0.05)。各組baPWV值均高于正常,其中肝腎陰虛組baPWV值明顯高于其他組(P0.05),且二者呈正相關(guān)(r=0.469)。痰瘀互結(jié)組以及瘀血阻滯組最大斑塊面積均高于其他組,最大斑塊面積同痰瘀互結(jié)證型呈中等程度正相關(guān)(r=0.342),同瘀血阻滯證型呈弱相關(guān)(r=0.122);痰濁中阻以及痰瘀互結(jié)組甘油三酯(triglyceride,TG)及總膽固醇(total cholesterol,TC)水平均高于肝陽上亢組以及肝腎陰虛組(P0.05),TG與痰濁中阻、痰瘀互結(jié)證型呈中等程度正相關(guān)(r=0.306;r=0.329),與瘀血阻滯證型呈弱正相關(guān)(r=0.179),TC與痰濁中阻、瘀血阻滯證型以及痰瘀互結(jié)證型均呈弱正相關(guān)(r=0.254;r=0.156;r=0.254),TG、TC與肝腎陰虛證及肝陽上亢證呈負(fù)相關(guān)。各證型患者的LDL-C均值水平都高于正常,但各組間患者高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在導(dǎo)師臨證處方中,黃芪、杜仲、刺蒺藜、淫羊藿、桑寄生、當(dāng)歸、川芎、牛膝、知母以及黃芩為導(dǎo)師治療高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的前十味常用藥。藥物分類以補(bǔ)虛藥、清熱藥、平肝熄風(fēng)藥、活血化瘀藥為最多,用藥頻次均在150次以上。導(dǎo)師常用藥對(duì)為杜仲-刺蒺藜藥對(duì)。2.刺蒺藜有效成分的提取及杜仲、刺蒺藜有效部位的篩選:粗浸膏經(jīng)萃取后得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水4部分,乙酸乙酯部分及正丁醇部分效果較好,經(jīng)粗分后被分為18個(gè)及8個(gè)部分。經(jīng)MTT法及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)篩選,刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15可明顯增強(qiáng)細(xì)胞活力及細(xì)胞遷移能力,且優(yōu)于其他部位。經(jīng)LC-ESI-MS/MS檢測刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15的有效物質(zhì)基礎(chǔ),共得到340個(gè)化合物(其中289個(gè)已知化合物),主要以膽堿類、黃酮類、生物堿類、維生素類以及有機(jī)酸類為主,其中乙酰膽堿、煙酸與內(nèi)皮功能密切相關(guān)。經(jīng)MTT法篩選,杜仲中槲皮素(Quercetin,QC)可明顯增強(qiáng)細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞增殖,且優(yōu)于其他杜仲有效部位(P0.05)。當(dāng)槲皮素與刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15以各自最佳濃度按比例為3:1配伍時(shí),促進(jìn)細(xì)胞增殖作用更強(qiáng),優(yōu)于其他比例配伍組(P0.05)。3.ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂機(jī)制的研究:使用ox-LDL干預(yù)HAEC后,同正常組比較,細(xì)胞總凋亡率上升、遷移率降低、細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸值、ATP產(chǎn)生量、最大呼吸值均降低(P0.05)。經(jīng)芯片檢測,ox-LDL誘導(dǎo)后共篩選得到532個(gè)差異lncRNA,其中298個(gè)lncRNA上調(diào),234個(gè)lncRNA下調(diào)(fold change≥2.0,P0.05);532個(gè)差異mRNA,其中195個(gè)mRNA上調(diào),337個(gè)mRNA下調(diào)(fold change≥2.0,P0.05)。差異lncRNA的功能主要與脂肪酸代謝、萜類骨架合成、PPAR信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、脂肪酸降解等多條內(nèi)皮功能相關(guān)的通路有關(guān)。經(jīng)敲減lncRNA NONHSAT061051的表達(dá),證實(shí)其可上調(diào)ICAM-1的表達(dá),升高ICAM-1相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)單核(THP-1細(xì)胞)-內(nèi)皮細(xì)胞黏附,參與ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。4.杜仲-刺蒺藜對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究:同ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷模型組比較,經(jīng)杜仲-刺蒺藜干預(yù)后細(xì)胞凋亡率降低,遷移能力提高,同時(shí)細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸值、ATP產(chǎn)生量、最大呼吸值均得到提高,單核細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)同內(nèi)皮細(xì)胞的黏附降低(P0.05)。經(jīng)芯片檢測,杜仲-刺蒺藜干預(yù)后,同模型組比較,共篩選得到149個(gè)差異lncRNA,其中69個(gè)lncRNA上調(diào),80個(gè)lncRNA下調(diào)(fold change≥2.0,P0.05);64個(gè)差異mRNA,其中11個(gè)mRNA上調(diào),53個(gè)mRNA下調(diào)(fold change≥2.0,P0.05)。差異lncRNA功能主要與甘油酯代謝、脂肪酸代謝、甘油磷脂代謝、黏附、JAK-STAT信號(hào)通路以及細(xì)胞因子受體相互作用等多條內(nèi)皮相關(guān)通路有關(guān)。其中,杜仲-刺蒺藜干預(yù)后使lnc-MAPK8-2:1、NONHSAT061051、lnc-MTHFD2L-1:1、lnc-CXCL3-1:1表達(dá)下調(diào),lnc-TK1-2:1、lnc-PKLR-1:1、lnc-TGFB3-5:1、lnc-KLHL10-2:1表達(dá)上調(diào),呈現(xiàn)對(duì)抗ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷作用。此外,經(jīng)杜仲-刺蒺藜干預(yù)后,NONHSAT061051下調(diào)的同時(shí),靶基因ICAM-1的表達(dá)水平也下降,ICAM-1編碼的蛋白表達(dá)也相應(yīng)降低。結(jié)論:年齡增加與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生存在一定關(guān)系,肝腎虧虛證是高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的主要證型,與baPWV呈正相關(guān)。高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者斑塊形成的同時(shí)多伴有血脂異常,斑塊的形成以及TG、TC水平的升高多與痰、瘀相關(guān),痰、瘀是高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵病理因素。導(dǎo)師治療高血壓合并動(dòng)脈粥樣硬化常用藥物以滋補(bǔ)肝腎、活血祛瘀藥為主,杜仲-刺蒺藜為常用藥對(duì)。從內(nèi)皮保護(hù)角度,刺蒺藜乙酸乙酯部分Fr.15為最佳有效部位,主要成分中乙酰膽堿、煙酸與內(nèi)皮功能較為密切,杜仲中槲皮素為最佳有效部位,當(dāng)槲皮素、刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15配伍比例為3:1(3μmol/L槲皮素:1.3 mg/L刺蒺藜乙酸乙酯Fr.15)時(shí),內(nèi)皮保護(hù)效果最好。ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,使血管內(nèi)皮細(xì)胞活力下降、凋亡率升高、遷移能力下降,并且損傷線粒體功能,導(dǎo)致ATP產(chǎn)生能力及呼吸儲(chǔ)備能力下降,其誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷的機(jī)制同lncRNA的調(diào)控有關(guān)。杜仲-刺蒺藜可通過調(diào)控lncRNA改善ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷,促進(jìn)細(xì)胞增殖及遷移,抑制細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞能量代謝水平。
【學(xué)位單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

20Ⅵ類：尿頻，自汗，視物模糊，惡心嘔吐，苔厚，脈澀。圖1 聚類分析垂直冰柱圖根據(jù)各聚類結(jié)果，當(dāng)聚為5類時(shí)四診信息分布最為合理，與臨床辨證分型最為符合。篩選5類證型，因第Ⅴ類癥狀中無明顯辨證特征故將其舍去，將Ⅰ類與Ⅱ類合為一類，共得到3個(gè)主要證型：肝腎陰虛證（Ⅱ類）、肝陽上亢證（Ⅲ類）以及痰瘀阻滯證（Ⅳ類）。依據(jù)聚類分析各分類的四診信息，統(tǒng)計(jì)每個(gè)聚類的案例數(shù)，查閱患者臨床資料，聚5類時(shí)第Ⅳ類根據(jù)癥狀偏倚又可分為痰濁中阻、瘀血阻滯以及痰瘀互結(jié)證。各組證素為患者的典型癥狀，實(shí)際多有兼加，聚類分析不能盡數(shù)體現(xiàn)，在此暫不討論。如表4所示

圖 2 藥物聚類垂直冰柱圖表 12 聚類分析藥物組合聚類群集數(shù) 藥物名稱 聚類群集數(shù) 藥物名稱1 黃芪 9 鉤藤、天麻、石決明2 杜仲、刺蒺藜 10 黃精、女貞子3 淫羊藿、桑寄生 11 厚樸、半夏、陳皮4 當(dāng)歸 12 夜交藤、合歡皮5 川芎、牛膝 13 瓜蔞、紅花、丹參、柴胡

經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇同50%的甲醇對(duì)粗浸膏進(jìn)行萃取后分別得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水4部分，分別為26.197 g，39.917 g，68.278 g，20 g。經(jīng)高效液相色譜分析，各部分峰值如圖3所示，結(jié)果顯示，乙酸乙酯及正丁醇部分有多個(gè)峰值，提示含有多個(gè)化合物成分。繼續(xù)將乙酸乙酯與正丁醇部分過硅膠柱粗分后分別得18個(gè)及8個(gè)部分，其中乙酸乙酯Fr. 10、Fr. 15和Fr. 17高效液相分析圖如圖4所示，F(xiàn)r. 10與Fr. 15中具有明顯峰值。注：A 石油醚層；B 乙酸乙酯層；C 正丁醇層；D 水層圖3 粗浸膏高效液相分析

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2817585