【摘要】：腦卒中因高發(fā)病率、高致殘率和高致死率給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前腦卒中治療藥物主要有以rt-PA為代表的溶栓、抗凝藥以及抗血小板聚集等化學(xué)藥物。由于腦缺血再灌注損傷過程涉及多細(xì)胞組分,有多種因素參與病程,上述藥物往往只針對單一環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù),因而效果有限。中醫(yī)藥是中華文明的瑰寶,是在勞動人民長期實(shí)踐活動中總結(jié)發(fā)展而成,強(qiáng)調(diào)全身論治,作為一種“整合醫(yī)學(xué)”在復(fù)雜疾病治療方面優(yōu)勢明顯。安腦片是安宮牛黃改方中藥,在保證藥效的同時(shí)降低了安宮牛黃的毒性和成本。盡管安腦片在臨床上療效顯著,但具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究基于大鼠大腦中動脈梗阻(MCAO)2 h后復(fù)灌誘導(dǎo)缺血再灌注損傷模型,觀察安腦片給藥治療對模型大鼠的保護(hù)作用,進(jìn)而討論安腦片的深入機(jī)制,為安腦片的臨床應(yīng)用提供理論支撐。第一部分安腦片抗腦缺血再灌注損傷藥效學(xué)研究1.建立大鼠缺血再灌注損傷模型,口服給藥1 d、7 d后評價(jià)治療效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,模型組大鼠的大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評分顯著增加(P0.001),安腦片可顯著降低大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評分(P0.001);2.TTC染色結(jié)果顯示,大鼠腦缺血再灌注急性期的腦梗死體積顯著增加(P0.001);而安腦片治療能夠顯著降低急性期大鼠腦梗死體積(P0.001);3.進(jìn)一步采用HE染色分析,在腦缺血再灌注急性期,模型組大鼠腦梗死體積明顯升高(P0.01),安腦片各治療劑量組則可以顯著降低急性期腦梗死體積(P0.05);4.分析腦缺血再灌注急性期及長期損傷組大鼠的腦損傷側(cè)半暗帶及梗死灶組織的NeuN功能性神經(jīng)元數(shù)目。數(shù)據(jù)結(jié)果表明,模型組大鼠神經(jīng)元丟失明顯(P0.001),而安腦片各治療劑量組則明顯減少了腦缺血再灌注大鼠大腦損傷側(cè)半暗帶、梗死灶區(qū)域神經(jīng)元的丟失(P0.001)。第二部分 安腦片抗腦缺血再灌注損傷作用機(jī)制研究1.首先分析了模型大鼠急性期損傷側(cè)梗死灶腦組織中的線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明,腦缺血再灌注急性期損傷(1 d)會顯著增加線粒體融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表達(dá)(P0.05,P0.05),而安腦片急性期干預(yù)治療組可顯著降低上述2個(gè)蛋白的表達(dá)水平,從而緩解線粒體融合分裂急性應(yīng)激的影響;2.通過進(jìn)一步分析急性期大鼠大腦損傷半球半暗帶中的線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白表達(dá)水平,可發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注急性期損傷(1d)能夠顯著降低線粒體融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表達(dá)(P0.05),安腦片急性期干預(yù)治療組則能夠明顯促進(jìn)OPA1和Drp1的表達(dá),從而發(fā)揮其改善線粒體動力學(xué)障礙的作用;3.同時(shí),通過觀察腦缺血再灌注長期損傷大鼠大腦的損傷半球梗死灶和半暗帶區(qū)域中的線粒體動力學(xué)相關(guān)蛋白表達(dá)水平,可發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注長期損傷(7d)大鼠的上述組織中線粒體融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表達(dá)水平顯著下降(P0.05,P0.05),安腦片長期干預(yù)治療組能夠明顯提高OPA1和Drp1的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮其改善線粒體動力學(xué)障礙的作用;4.大鼠大腦損傷半球的半暗帶、梗死灶區(qū)域中的線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,腦缺血再灌注急性期和長期損傷(1 d和7d)會顯著降低PINK1/Parkin的表達(dá)(P0.05),安腦片急性期干預(yù)治療組和長期干預(yù)治療組均能顯著升高上述兩個(gè)蛋白的表達(dá)水平,從而促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)線粒體自噬過程。5.此外,缺血再灌損傷顯著降低Bcl-2/Bax的比例(P0.05),安腦片急性期干預(yù)治療組和長期干預(yù)治療組可明顯提高大鼠損傷側(cè)半暗帶和梗死灶組織的Bcl-2/Bax的比例(P0.05,P0.001),抑制細(xì)胞凋亡。第三部分安腦片對神經(jīng)微環(huán)境膠質(zhì)細(xì)胞及其表型轉(zhuǎn)化的影響1.對大鼠損傷側(cè)半暗帶、梗死灶區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,在腦缺血急性期,半暗帶組織中,星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.001);梗死灶組織中,星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少(P0.001)、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.001),而安腦片干預(yù)1天組大鼠皮層的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯增多;在腦缺血長期損傷中,半暗帶組織中,星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.001);梗死灶組織中,星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少(P0.01)、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.001);而安腦片干預(yù)7天組對星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量無明顯影響;2.進(jìn)一步對大鼠損傷側(cè)半暗帶區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞活化分型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,腦缺血再灌注損傷1d和7d后A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.05,P0.001)、A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P0.05);而安腦片1d干預(yù)治療組和7d干預(yù)治療組可顯著降低A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量(P0.05,P0.01),同時(shí)顯著增加A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量(P0.01,P0.05);3.對大鼠損傷側(cè)半暗帶小膠質(zhì)細(xì)胞活化分型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,腦缺血再灌注損傷1 d和7d后M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.05)、M2型星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P0.05);而安腦片1d干預(yù)治療組和7d干預(yù)治療組可顯著降低M1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量(P0.01,P0.001),同時(shí)顯著增加M2型星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量(P0.01,P0.05)。4.為了進(jìn)一步研究神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用,在大鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞上建立OGD/R模型,采用造模后不同時(shí)間點(diǎn)A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基與神經(jīng)元共培養(yǎng)24 h,對正常與損傷神經(jīng)元的IOD值檢測結(jié)果顯示,星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠顯著增加神經(jīng)元活性,并且72 h的條件培養(yǎng)基的神經(jīng)保護(hù)作用達(dá)到最高。5.采用造模后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元條件培養(yǎng)基與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)24 h,對正常與損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率檢測結(jié)果顯示,神經(jīng)元條件培養(yǎng)基對星形膠質(zhì)細(xì)胞無明顯影響。綜上,我們研究發(fā)現(xiàn)安腦片短期給藥和持續(xù)給藥對腦缺血再灌注模型大鼠腦組織均呈現(xiàn)良好的神經(jīng)保護(hù)作用,可顯著改善缺血再灌所致的線粒體功能障礙,抑制神經(jīng)元的凋亡。安腦片能夠通過對缺血損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞活化分型的改變,有效維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài),改善受損后的腦功能。本研究為安腦片抗腦缺血再灌注損傷的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)和理論支持。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

邐北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文邐逡逑ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｉｎ邋ｒａｔｓ邋ｏｎｅ邋ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｓｃｈｅｍｉｃ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．邋（Ａ）邋Ｏｎｅ邋ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ逡逑ＭＣＡＯ，邋ｉｎ邋ｉｓｃｈｅｍｉｃ邋ｃｏｒｔｅｘ邋ｐｅｎｕｍｂｒａ，邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｄｒｐｌ邋ａｎｄ邋ＯＰＡ１邋ｗｅｒｅ逡逑ａｎａｌｙｚｅｄ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｂａｎｄ邋ｗａｓ邋ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ邋ｔｏ邋ｔｈａｔ邋ｏｆ邋ｐ－ａｃｔｉｎ．邋（Ｂ）邋Ｏｎｅ邋ｄａｙ逡逑ａｆｔｅｒ邋ＭＣＡＯ，邋ｉｎ邋ｉｓｃｈｅｍｉｃ邋ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｄｒｐｌ邋ａｎｄ邋ＯＰＡ１邋ｗｅｒｅ邋ａｎａｌｙｚｅｄ逡逑ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｂａｎｄ邋ｗａｓ邋ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ邋ｔｏ邋ｔｈａｔ邋ｏｆ邋Ｐ－ａｃｔｉｎ．邋Ｄａｔａ邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ逡逑ｍｅａｎ邋士邋ＳＥＭ，邋＊Ｐ邋＜邋０．０５，邋＊＊Ｐ邋＜邋０．０１邋ｖｓ邋Ｓｈａｍ；邋＜邋０．０５，邐＜邋０．０１邋ｖｓ邋Ｍｏｄｅｌ，邋ｎ邋＝邋３．逡逑

跡測量缺血半暗帶組織和梗死灶中凋亡相關(guān)蛋白（Ｂｃｌ－２，邋Ｂａｘ）的水平。缺血再灌逡逑注急性期和長期損傷后，Ｂｄ－２／Ｂａｘ的比例顯著降低。安腦片急性干預(yù)組和長期干逡逑預(yù)組可以提T跡攏悖歟玻攏幔壤撓跋歟幔罰稅材云瘟頗芄豢瓜赴魍觶

本文編號：2813960