發(fā)布時(shí)間：2020-09-07 21:20

　　 背景:姜黃素(Curcumin)是從植物姜黃中分離出來(lái)具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性的天然多酚,具有潛在的臨床價(jià)值。因姜黃素水溶解性差,口服生物利用度低,極大限制其臨床應(yīng)用。我們通過(guò)構(gòu)建聚乙二醇修飾后的姜黃素衍生物(Curc-mPEG454),明顯改善姜黃素的水溶性和生物利用度。前期研究證實(shí)Curc-mPEG454減輕肝纖維化程度與顯著抑制環(huán)氧合酶2(COX-2)表達(dá)密切相關(guān)。因此,本研究采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7作為炎癥模型,以姜黃素、阿司匹林、NS-398和維生素C做對(duì)照,在體外系統(tǒng)評(píng)估Curc-mPEG454抗炎和抗氧化活性,并闡明其可能的分子作用機(jī)制。材料與方法:1.細(xì)胞模型和分組:用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞,待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)將細(xì)胞分為七組:正常對(duì)照組,LPS模型組,CurcmPEG454(16μM),姜黃素(16μM),阿司匹林(100μM),NS-398(50μM)和維生素C(300μM)預(yù)處理2h,隨后,除正常對(duì)照組外,其余各組均用1μg/ml脂多糖(LPS)刺激細(xì)胞24小時(shí)。2.炎癥因子的檢測(cè):ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清中炎癥因子的含量,包括白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)。熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測(cè)環(huán)氧合酶-2(COX-2)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA的表達(dá)水平。Western Blot檢測(cè)COX-2和iNOS的蛋白表達(dá)水平。3.ROS的檢測(cè):DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的ROS,使用激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞活性氧類的(ROS)水平。4.抗氧化活性的檢測(cè):的蛋白和mRNA的表達(dá)。酶活性檢測(cè)試劑盒和PCR檢測(cè)了細(xì)胞中抗氧化酶類,包括血紅素加氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)酶的活性以及他們的mRNA表達(dá)水平。5.核轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè):Real-Time PCR和Western Blot分別檢測(cè)(NF-κB),-c-Jun的核蛋白和mRNA的表達(dá)水平,同時(shí)應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)NF-κB p65的和轉(zhuǎn)位情況和p-c-Jun核內(nèi)表達(dá)的情況。6.統(tǒng)計(jì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS19.0軟件中的單因素方差分析組間數(shù)據(jù)是否具有差異性,當(dāng)P0.05認(rèn)為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.Curc-mPEG454抑制炎癥介質(zhì)的釋放:Curc-mPEG454(IC50 57.8μM)與姜黃素(IC50 32.6μM)相比,其細(xì)胞毒性較低,并呈濃度依賴性抑制炎性細(xì)胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和MCP-1的釋放。在相同濃度下,16μM CurcmPEG454也顯示出比姜黃素更強(qiáng)的對(duì)炎癥細(xì)胞因子的抑制作用(P0.05)。2.Curc-mPEG454顯著下調(diào)COX-2表達(dá),減少PEG2生成:LPS誘導(dǎo)升高細(xì)胞COX-2的表達(dá)量,而Curc-mPEG454(16μM)最能夠抑制COX-2蛋白和mRNA的表達(dá)繼而抑制前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生,卻不影響COX-2酶的活性。阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)能夠明顯降低PGE2的水平,主要通過(guò)抑制COX-2酶的活性但并不顯著改變COX-2的表達(dá)水平。3.Curc-mPEG454抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位和降低p-c-jun水平。在模型組中LPS誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位和p-c-jun的表達(dá)水平升高,與模型組比較,細(xì)胞核內(nèi)的熒光結(jié)果顯示Curc-mPEG454(16μM)明顯減少LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位和p-c-jun磷酸化水平。而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)輕微減少了NF-κB p65核轉(zhuǎn)位和p-c-jun的表達(dá)水平。Curc-mPEG454降低LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)位和p-c-jun的表達(dá)水平是最為明顯的。4.Curc-mPEG454抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS表達(dá),NO和ROS產(chǎn)生:CurcmPEG454(16μM)能明顯降低LPS誘導(dǎo)的iNOS的產(chǎn)生并抑制NO和ROS的生成,而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)則并不能降低LPS誘導(dǎo)的ROS和NO的產(chǎn)生。而Curc-m PEG454(16μM)和Curcumin(16μM)的抑制效果基本相同。5.Curc-mPEG454通過(guò)激活Nrf2及下游抗氧化酶類發(fā)揮抗氧化作用:CurcmPEG454(16μM)在6h、12h、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)Nrf2核蛋白和mRNA的表達(dá)呈先升高后下降的趨勢(shì)。在炎癥的早期,Curc-mPEG454(16μM),Curcumin(16μM)和維生素C(300μM)能夠通過(guò)激活Nrf2,升高其下游的抗氧化酶類HO-1,GSH,SOD,CAT的活性,而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)并不能升高Nrf2的表達(dá)和其下游的抗氧化酶的活性。Curc-mPEG454具有和Curcumin、維生素C等同的抗氧化能力。結(jié)論:Curc-mPEG454通過(guò)抑制NF-κB p65核移位,抑制c-Jun磷酸化和抑制COX-2的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。其次,Curc-mPEG454通過(guò)增加Nrf2的表達(dá),升高其下游的HO-1,GSH,SOD,CAT等抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用。聚乙二醇化姜黃素不僅改善姜黃素的水溶性,提高其生理活性,而且作用于炎癥反應(yīng)和抗氧化反應(yīng)的的多個(gè)靶點(diǎn),其抗炎效果優(yōu)于阿司匹林和NS-398,抗氧化能力等同維生素C。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

圖 1. 姜黃素和聚乙二醇化姜黃素衍生物Figure 1.The chemical structure of Curcumin and Curc-mPEG454主要實(shí)驗(yàn)試劑 供應(yīng)商姜黃素 Sigma-AldrichLPS Sigma-Aldrich維生素 C Sigma-Aldrich阿司匹林 Sigma-AldrichNS398 Cayman chemical氯仿 重慶醫(yī)科大學(xué)設(shè)備與試劑中心甲醇 重慶醫(yī)科大學(xué)設(shè)備與試劑中心10 X loading buffer TaKaRaRnase-free 水 TaKaRaDMEM Gibco（美國(guó)）胎牛血清 Gibco（美國(guó)）雙抗(PS) 實(shí)驗(yàn)室配制0.25%胰蛋白酶 實(shí)驗(yàn)室配制

圖 2. Curc-mPEG454 對(duì) RAW264.7 細(xì)胞活力的影響。Figure. 2 Effects of Curc-mPEG454 on RAW264.7 cell viability. Cells were pretreated wiincreasing concentrations of Curc-mPEG454 or curcumin for 2h, then incubated in medcontaining LPS (1μg/mL) for 24h at 37℃. Cell viability was determined by using acolorimetric MTT assay. The data shown represent the mean ±SD, from three independeexperiments..2 Curc-mPEG454抑制LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子姜黃素具有較好的抗炎能力可能是通過(guò)其抑制炎癥前細(xì)胞因子如腫瘤壞子（TNF-α），白細(xì)胞介素（IL）-1,6，環(huán)氧合酶-2（COX-2）和誘導(dǎo)型一氮合酶（iNOS）[17]。在這里，我們研究了Curc-mPEG454對(duì)LPS激活A(yù)W264.7細(xì)胞中幾種關(guān)鍵炎癥因子IL-1，IL-6，TNF-α和MCP-1的抑制作用姜黃素（16μM），阿司匹林（100μM）[18]和NS-398（50μM）相比[19]。如A，B所示，Curc-mPEG454以濃度依賴性方式抑制IL-6和TNF-α的炎癥因子

19圖3. Curc-mPEG454對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。Figure. 3 Effects of Curc-mPEG454 on LPS-induced inflammatory cytokineproduction.RAW264.7 cells were pretreated with indicated concentrations of Curc-mPEG454, curcumin, aspirin and NS-398 for 2h, and then were activated with 1μg/mL LPSfor 24h. Cell culture media was collected and analyzed for IL-6 (A) and TNF-α (B) levelsusing ELISA kit. Gene expression of IL-1β (C) and MCP-1 (D) was calculated usingcomparative cycle threshold (CT) method normalized to the house keeping gene GAPDH.The data shown represent mean ±SD, from three independent experiments.###P < 0.001vscontrol group; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001vs model group.3.3 Curc-mPEG454抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)和前列腺素E2的合成姜黃素與NSAIDs均能抑制前列腺素（PGs）合成起到對(duì)抗炎癥的作用[20]。環(huán)氧合酶（COX）是負(fù)責(zé)將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGs的關(guān)鍵酶。越來(lái)越多的證據(jù)表

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 黃小華;孫永;沈能;唐華東;任紅;彭明利;;雙親姜黃素衍生物減輕大鼠肝纖維化與抗炎抗氧化作用的研究[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2015年04期

2 楊正生;彭振輝;李曉莉;宋健文;任建文;;姜黃素對(duì)IL-17誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞NO合成以及iNOS表達(dá)的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年09期

3 李祖國(guó);劉騰飛;謝衛(wèi)兵;周軍;余力;丁彥青;;環(huán)氧化酶2基因異常表達(dá)與大腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年10期

4 Wai K．Leung;Ka-Fai To;Alfa H．C．Bai;Po-Ki Ma;Minnie Y.Y.Go;Joseph J．Y．Sung;;Different cell kinetic changes in rat stomach cancer after treatment with celecoxib or indomethacin: Implications on chemoprevention[J];World Journal of Gastroenterology;2005年01期

本文編號(hào)：2813849