目的:構建再生障礙性貧血小鼠模型,觀察穿龍薯蕷皂苷對再生障礙性貧血小鼠的治療作用,探討穿龍薯蕷皂苷是否可通過調(diào)節(jié)再生障礙性小鼠Notch信號通路影響Th17/Treg細胞平衡,進而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫促進造血的治療作用。方法:1.再障小鼠模型的建立及評估:采用照射聯(lián)合化學藥物損傷法建立再生障礙性小鼠模型。將BALB/c雄性小鼠隨機分為對照組(n=10)和模型組(n=60),模型組小鼠經(jīng)~(137)Cs照射后,于第4、5、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺(25mg/kg/d)和氯霉素(62.5mg/kg/d)。對照組予鉛磚屏蔽行假照射,腹腔注射等體積生理鹽水。第7天檢測造模小鼠的血常規(guī)、骨髓細胞涂片進行模型評估,外周血白細胞、血紅蛋白、血小板、網(wǎng)知紅細胞計數(shù)下降至正常血象一半以下,且骨髓細胞涂片顯示骨髓增生減低或重度減低,視為成模。2.觀察穿龍薯蕷皂苷對再障小鼠的藥效學研究:將成模小鼠隨機分為6組:模型組,穿龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組(37.44,74.88,149.76mg/kg/d),雷公藤多苷組(9.36mg/kg/d),環(huán)孢素組(23.5mg/kg/d),模型組和對照組予等體積蒸餾水,灌胃14天。第22天檢測各組小鼠外周血細胞計數(shù)、骨髓細胞涂片評價骨髓增生情況。3.穿龍薯蕷皂苷調(diào)節(jié)AA小鼠Notch信號通路的機制研究:灌胃結束后,采用FCM法檢測各組小鼠外周血Th17、Treg占CD4~+T細胞的比值,分析穿龍薯蕷皂苷對AA小鼠Th17/Treg免疫細胞平衡的影響;Q-PCR、Western-blot法檢測各組小鼠脾臟RORγt、Foxp3、Notch1、Jagged1、Dll4、RBP-JκmRNA和蛋白表達,探究穿龍薯蕷皂苷對AA小鼠Notch相關信號表達的影響;IP檢測RBP-Jκ分別與RORγt、Foxp3蛋白結合量,探討穿龍薯蕷皂苷是否可通過調(diào)節(jié)Notch信號通路干預AA小鼠Th17/Treg細胞平衡,進而發(fā)揮促造血的作用機制。結果:1.模型組小鼠外周血WBC、Hb、PLT、RET計數(shù)明顯低于對照組(P0.05),各治療組小鼠較模型組血象均有不同程度回升,以穿龍薯蕷皂苷中劑量組和環(huán)孢素組療效較佳。2.與對照組小鼠相比,模型組小鼠骨髓增生低下,骨髓細胞數(shù)量減少。經(jīng)治療后,各組小鼠較模型組骨髓細胞數(shù)量增多,骨髓增生活躍。穿龍薯蕷皂苷中劑量組、高劑量組及環(huán)孢素組效果較佳。3.與對照組相比,模型組小鼠外周血Th17細胞占CD4~+T細胞比值增多(P0.05),Treg細胞占CD4~+T細胞比值減少,Th17/Treg細胞比值上升(P0.05),差異有統(tǒng)計學意義。與模型組相比,各治療組出現(xiàn)相同的趨勢,即Th17細胞所占比值下降、Treg細胞所占比值上升,穿龍薯蕷皂苷中劑量組小鼠外周血中Th17/Treg細胞比值下降顯著(P0.01),但Treg上升不明顯,與環(huán)孢素組相比無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.與對照組小鼠相比,模型組小鼠脾臟Notch1、Foxp3、Jagged1 mRNA與蛋白表達水平降低(P0.05),Dll4、RORγt mRNA與蛋白表達升高(P0.05)。經(jīng)治療后,各組小鼠脾臟Notch1、Foxp3、Jagged1 mRNA與蛋白表達水平存在不同程度升高,Dll4、RORγt mRNA與蛋白表達水平存在不同程度降低,以穿龍薯蕷皂苷中劑量組和環(huán)孢素組最為明顯(P0.05)。對照組、模型組及各治療組間小鼠脾臟RBP-JκmRNA和蛋白表達均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。5.與對照組相比,模型組RBP-Jκ與RORγt蛋白結合量增多(P0.05),RBP-Jκ與Foxp3蛋白結合量降低(P0.05)。經(jīng)治療后,與模型組相比,穿龍薯蕷皂苷中劑量組、環(huán)孢素組RBP-Jκ與RORγt蛋白結合量降低(P0.05),RBP-Jκ與Foxp3蛋白結合量增多(P0.05),差異存在統(tǒng)計學意義。結論:穿龍薯蕷皂苷能夠顯著升高及維持再生障礙性小鼠外周血中WBC、Hb、PLT、RET計數(shù)水平,增加骨髓細胞數(shù)量,改善骨髓造血功能。其可能作用機制為:穿龍薯蕷皂苷可抑制再障小鼠體內(nèi)Th17細胞數(shù)量及轉錄因子RORγt的表達,提高Treg細胞數(shù)量及轉錄因子Foxp3的表達水平,促進Th17/Treg細胞比例恢復平衡,促進機體免疫穩(wěn)態(tài)的恢復。而Notch信號可參與這一過程,穿龍薯蕷皂苷通過影響再生障礙性貧血小鼠體內(nèi)Notch1信號受體及Dll4、Jagged1配體的表達水平,進而影響下游信號的轉導,并且Notch信號中RBP-Jκ可直接結合RORγt、Foxp3蛋白,穿龍薯蕷皂苷可能通過提高Notch中RBP-Jκ與Foxp3蛋白結合量、降低RBP-Jκ與RORγt蛋白結合量,進而促進Th17/Treg細胞免疫平衡的恢復。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R285.5

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本文編號：2812608