狹山野豌豆為豆科野豌豆屬植物(V.amoena Fisch.var.Angusta.Freyn),味甘、性平,具有活血、解毒、通絡(luò)、行水的功效,為蒙藥透骨草山野豌豆的變種,在民間亦作為透骨草被廣為使用。臨床上多用于祛風(fēng)除濕,活血止痛等病癥,屬于舒筋活絡(luò)型祛風(fēng)濕藥。目前,關(guān)于狹山野豌豆化學(xué)成分、生物活性的報道屈指可數(shù)。因此本課題組對狹山野豌豆水提液乙酸乙酯層及多糖進行化學(xué)分離,得到單體化合物和通過乙醇沉淀得到的不同多糖部位,并對單體化合物和不同多糖部位進行免疫活性研究,考察了狹山野豌豆單體化合物和多糖對巨噬細胞NO釋放量、吞噬中性紅能力、遷移能力和對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響,具體方法和結(jié)果如下:1、狹山野豌豆單體化合物提取分離利用硅膠、Sephadex LH-20、ODS柱層析、制備型TLC以及HPLC等分離純化方法,對狹山野豌豆水提取物的乙酸乙酯層進行化學(xué)分離,得到18個單體化合物,根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定了17個化合物的結(jié)構(gòu),分別為山柰酚(1)、槲皮素(2)、苜蓿素(3)、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(4)、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷(5)、槲皮苷(6)、異槲皮苷(7)、山柰苷(8)、漢黃芩素(9)、金絲桃苷(10)、楊梅苷(11)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(12)、山柰酚-7-O-β-D-葡萄糖苷(13)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖(14)、綠原酸(15)、胡蘿卜苷(16)、β-谷甾醇(17)。其中化合物12-14為首次從狹山野豌豆中分離得到。2、狹山野豌豆多糖的制備與分離(1)酶解法提取狹山野豌豆多糖的工藝研究采用單因素法考察了狹山野豌豆多糖提取酶的種類及酶的最適使用量,通過正交試驗確定了最適提取酶的最優(yōu)提取時間、溫度、p H值和提取次數(shù)。結(jié)果確定狹山野豌豆多糖的最優(yōu)提取條件為,采用復(fù)合提取酶,最適的使用量為2.5%;提取次數(shù):2次;提取溫度:60℃;提取時間:1小時;提取p H值:4.0。最終驗證結(jié)果,利用最優(yōu)的提取條件提取狹山野豌豆多糖的提取率為11.6%。(2)狹山野豌豆多糖的分離采用水提醇沉的方法將狹山野豌豆多糖提取液進行不同濃度乙醇分級沉淀,冷凍干燥,得到4個多糖部位,分別為30%多糖、50%多糖、70%多糖和90%多糖。3、狹山野豌豆單體化合物和多糖的免疫活性研究考察狹山野豌豆單體化合物和多糖對巨噬細胞NO的釋放量、遷移能力、吞噬中性紅能力和小鼠脾淋巴細胞增殖的影響。實驗結(jié)果表明:(1)狹山野豌豆總多糖中分離得到的4個多糖部位能不同程度地激活巨噬細胞釋放NO,通過與MTT實驗相結(jié)合,確定了4個多糖部位的最適給藥濃度:30%多糖和50%多糖部位為0.06μg/ml、0.23μg/ml、0.94μg/ml、3.75μg/ml;70%多糖和90%多糖部位最適給藥濃度為0.94μg/ml、3.75μg/ml、15μg/ml、60μg/ml。(2)采用劃痕法,測定巨噬細胞的遷移能力。結(jié)果表明,狹山野豌豆4個多糖部位對巨噬細胞的細胞遷移均無影響。(3)巨噬細胞吞噬中性紅實驗發(fā)現(xiàn),考察的8個單體化合物中,除了綠原酸外,異槲皮苷、山柰酚、槲皮素、漢黃芩素、金絲桃苷、山柰苷和槲皮苷均能不同程度地增強巨噬細胞吞噬中性紅的能力;狹山野豌豆的4個多糖部位也都能顯著地增強巨噬細胞吞噬中性紅的能力,對吞噬率的影響分別為30%多糖50%多糖70%多糖90%多糖。(4)在小鼠脾淋巴細胞增殖實驗中,考察了6個單體化合物的免疫活性,化合物單獨給藥時,異槲皮苷、槲皮素、漢黃芩素、槲皮苷和山柰苷均能不同程度地增強小鼠脾淋巴細胞的增殖能力,而山柰酚則無影響。細胞經(jīng)LPS處理后,槲皮素、漢黃芩素、槲皮苷均能在不同給藥濃度下與單獨LPS處理相比,顯著地提高脾淋巴細胞增殖能力,其余單體均無影響;細胞經(jīng)ConA處理后,異槲皮苷提高脾細胞的增殖能力最強,漢黃芩素、槲皮苷和山柰苷均能在不同給藥濃度下與單獨使用Con A處理相比增殖能力顯著提高,但槲皮素增殖能力顯著降低,由此推測槲皮素對Con A的增殖能力具有抑制作用,其余單體均無影響。(5)30%多糖和50%多糖能不同程度地提高小鼠脾淋巴細胞的增殖能力,且50%多糖提高小鼠脾淋巴細胞的增殖能力要優(yōu)于30%多糖。而70%、90%多糖對脾淋巴細胞的增殖無影響。綜上所述,本文對狹山野豌豆提取液乙酸乙酯層進行系統(tǒng)化學(xué)分離,得到18個化合物,鑒定17個化合物的結(jié)構(gòu),其中3個化合物為首次從狹山野豌豆中分離得到。并首次對狹山野豌豆的多糖提取工藝進行了考察,篩選出適合的提取酶和最優(yōu)提取條件,首次對狹山野豌豆多糖不同分離部位與單體化合物的免疫活性進行研究,表明狹山野豌豆具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力,為狹山野豌豆豐富資源的開發(fā)與利用提供了科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R284;R285.5
【部分圖文】：

總多糖溶液中加入 95%乙醇，使體系中的乙醇終濃度至 30%，離心，上清液重復(fù)以上操作，合并沉淀得 30%多糖。（2）中得到的上清液中加入 95%乙醇，使體系中的乙醇終濃靜置一夜，離心，上清液重復(fù)以上操作，合并沉淀得 50%多（3）中得到的上清液中加入 95%乙醇，使體系中的乙醇終濃靜置一夜，離心，上清液重復(fù)以上操作，合并沉淀得 70%多（4）中得到的上清液中加入 95%乙醇，使體系中的乙醇終濃靜置一夜，離心，上清液重復(fù)以上操作，合并沉淀得 90%多得到的 30%多糖、50%多糖、70%多糖和 90%多糖凍干，得置于干燥器中備用。分析糖標(biāo)準曲線)中方法，得葡萄糖標(biāo)準曲線，結(jié)果如圖 2-1所示。

圖 2-2 各因素水平效應(yīng)曲面圖由直觀分析結(jié)果和方差分析結(jié)果可知：影響復(fù)合提取酶提取狹山野豌豆多糖的提取率的因素：溫度（B）、pH 值（D）、提取次數(shù)（A）、時間（C）均為非顯著影響因素。各因素各水平之間的趨勢為：B3>B2>B1；D1>D2>D3；A2>A3>A1；C2>C1>C3，其中溫度和 pH 值對狹山野豌豆多糖的提取率影響相對較大。通過直觀分析表結(jié)合節(jié)約能源節(jié)省時間等因素，確定最優(yōu)的提取工藝為A2B3C1D1，即最優(yōu)提取工藝為提取溫度為 60℃，提取時間為 1 小時，提取次數(shù)為 2次，提取 pH值為 4.0。2.4.4 正交試驗驗證實驗結(jié)果按照 2.4.4的正交試驗結(jié)果得到的最優(yōu)提取工藝對狹山野豌豆的粉末進行提取，稱取 5g 藥材三份，置于 250mL 的錐形瓶中，加水 125mL，2.5%復(fù)合提取酶、調(diào)節(jié) pH 值為 4.0，放于恒溫水浴鍋中在 60℃的溫度下進行提取，提取時間1 小時，提取 2 次，合并提取液，濃縮，加水溶解，測多糖提取率如表 2-7 所示。

41圖 3-1 MTT 法考察多糖不同部位對巨噬細胞存活率的影響MTT（噻唑藍）法是一種檢測細胞存活率的常用方法，原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細胞無此現(xiàn)象，再通過 DMSO 溶解甲瓚，檢測 OD 值間接反映細胞的存活率。由圖 3-1 所示，30%多糖部位在濃度為 1-6 時對巨噬細胞的存活率影響不大，特別是當(dāng)多糖濃度在 3、4時，更能促進巨噬細胞的增殖，但當(dāng)濃度為 7-8 時，細胞毒性顯著增強，細胞數(shù)量不足空白的 50%，由此推斷，30%多糖的給藥濃度為 1-6 時，對細胞是安全的，即給藥濃度為 0.004μg/ml-3.75μg/ml；50%多糖部位在濃度在 1-7 時，藥物對細胞的存活率影響都不是很大，但當(dāng)濃度達到 8 時，細胞的存活率明顯下降，由此推斷，50%多糖的給藥

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2810667