目的:基于Caco-2細(xì)胞模型研究PEPT1對朱砂跨膜吸收的介導(dǎo)作用,進(jìn)一步闡明朱砂的吸收機(jī)制。方法:1.建立UPLC-ICP/MS分析方法檢測給藥后Caco-2細(xì)胞模型中刷狀緣側(cè)(AP側(cè)),細(xì)胞內(nèi)和基底側(cè)(BL側(cè))的無機(jī)汞含量。2.建立Caco-2細(xì)胞模型,并通過細(xì)胞形態(tài)學(xué),跨膜電阻值及熒光素滲透率來評價(jià)Caco-2細(xì)胞單層膜的完整性。3.建模成功后,設(shè)置空白對照組、朱砂組、硫化汞組和氯化汞組進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。(1)考察朱砂、硫化汞和氯化汞在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)水平:分別將0.2μM的朱砂,硫化汞和氯化汞與Caco-2細(xì)胞孵育6 h,收集含藥培養(yǎng)基后加入新的含藥培養(yǎng)基,共計(jì)4次,末次給藥6 h后,用UPLC-ICP/MS檢測4次收集的AP、BL側(cè)培養(yǎng)基及細(xì)胞內(nèi)無機(jī)汞含量。(2)PEPT1的基因及蛋白表達(dá):將上述細(xì)胞樣本經(jīng)前處理后,采用RT-PCR和Western-blot法檢測PEPT1在基因和蛋白水平上的變化。(3)抑制PEPT1對朱砂、硫化汞和氯化汞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響:分別采用siRNA沉默和化學(xué)抑制法抑制Caco-2細(xì)胞中PEPT1的活性,然后考察朱砂、硫化汞和氯化汞在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)水平。結(jié)果:1.建立了靈敏、高效、快速的UPLC-ICP/MS檢測方法,可滿足對樣本中無機(jī)汞含量檢測的要求。2.Caco-2細(xì)胞單層模型具有良好的緊密性和完整性,其跨膜電阻值大于500Ω.cm~2且熒光素滲透率小于1×10~(-6) cm/s,表明本實(shí)驗(yàn)建立的Caco-2細(xì)胞單層模型可用于朱砂、硫化汞和氯化汞的轉(zhuǎn)運(yùn)研究。3.給予朱砂、硫化汞和氯化汞后,在AP側(cè),朱砂、硫化汞和氯化汞中的無機(jī)汞含量分別約占總汞(總添加量)的97.71%,97.72%,97.56%;在細(xì)胞內(nèi),朱砂、硫化汞和氯化汞中的無機(jī)汞含量分別約占總汞的1.95%,1.81%,1.77%;在BL側(cè),朱砂、硫化汞和氯化汞中的無機(jī)汞含量分別約占總汞的0.34%,0.47%,0.68%。朱砂組和硫化汞組中的無機(jī)汞的含量為氯化汞組的49.39%和30.41%。4.與對照組相比,朱砂和硫化汞顯著降低Caco-2細(xì)胞中PEPT1 mRNA的表達(dá)水平,朱砂顯著降低了PEPT1蛋白的表達(dá)水平,硫化汞也可下調(diào)PEPT1蛋白的表達(dá)水平,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.朱砂,硫化汞或氯化汞與PEPT1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞孵育后,與對照組相比,朱砂中的無機(jī)汞在細(xì)胞內(nèi)含量減少了30.03%,在BL側(cè)含量減少了57.85%。硫化汞中無機(jī)汞含量在AP側(cè),細(xì)胞內(nèi)及BL側(cè)均無明顯差異。氯化汞中的無機(jī)汞在BL側(cè)的含量增加了34.48%。6.給予布洛芬后,與對照組相比,朱砂中的無機(jī)汞在BL側(cè)的含量減少了33.32%。而硫化汞和氯化汞中的無機(jī)汞的轉(zhuǎn)運(yùn)在AP側(cè),細(xì)胞內(nèi)及BL側(cè)均無明顯差異。結(jié)論:(1)朱砂、硫化汞的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)水平低于氯化汞;(2)PEPT1介導(dǎo)了朱砂在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R285
【部分圖文】：

圖 1 藥物在 Caco-2 細(xì)胞單層膜吸收實(shí)驗(yàn)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of transport of drug across Caco-2 cell monolayers.3.5 總 RNA 提取及 RT-PCR 測定取培養(yǎng)至 21 天左右的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)基，用 37℃HBSS 液輕柔的清洗細(xì)胞層 3 次以去除細(xì)胞表面上的雜質(zhì)，最后一次將含 37℃HBSS 液的細(xì)胞置于 CO2箱中孵育 30min。棄去 AP 側(cè)和 BL 側(cè)的 HBSS 液，將細(xì)胞與含朱砂（0.2μM）、化汞（0.2 μM）或氯化汞（0.2 μM）的完全培養(yǎng)基溫孵 24 h，其中以 6、12、8、24 h 的時(shí)間點(diǎn)從 AP 側(cè)取出 100 μL 全部藥液，并立即向其中加入相同體積新鮮的含朱砂，硫化汞或氯化汞的完全培養(yǎng)基以替換取樣結(jié)果損失的體積。24 后用事先預(yù)冷的 D-hanks 快速清洗細(xì)胞表面 3 次并加入 200 μL Trizol，根據(jù)AKARA 公司提供的說明提取總的 RNA。利用 ND-2000 超微量分光光度計(jì)測NA 濃度，比率在 1.8＜ OD260/OD280＜ 2.1 范圍內(nèi)表示 RNA 純度符合要求。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，引物用 primer3 軟件設(shè)計(jì)并列出。15 μL 的 PCR

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 吳青2 結(jié)果2.1 Caco-2 細(xì)胞模型建立2.1.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查[34]用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，由圖 2 表明培養(yǎng) 21 天的 Caco-2 細(xì)胞已形成致密的單層膜且細(xì)胞形態(tài)良好，可清楚的觀察到細(xì)胞間界限。圖 A 為培養(yǎng)瓶里的Caco-2 細(xì)胞，圖 B 為 Caco-2 細(xì)胞在 Transwell 板里生長到 21 天的狀態(tài)。

圖 3 Caco-2 細(xì)胞單層模型跨膜電阻值Fig. 3 Transepithelial electrical resistances value of Caco-2 cell monolayers.3 熒光素滲透率Caco-2 細(xì)胞單層模型通透性的驗(yàn)證通常都是通過測定胞旁或跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)Papp來判斷的[36]。我們選擇了熒光素為細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)志物，結(jié)果顯示熒光的 Papp在參考范圍之類，即小于 1×10-6cm/s，表明細(xì)胞單層滲透率正 4。表 4 熒光素的表觀滲透系數(shù)Table. 4 Pappof the markers of transcellular transport標(biāo)志物Papp/1×10-6cm/s參考值/1×10-6cm/s熒光素 0.11±0.04 <1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張_,郭俊生,秦海宏;高濃度鋅對Caco-2細(xì)胞生長的影響[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2004年06期

2 龔濤;范遠(yuǎn)景;王明和;劉培志;徐柳;楊登玲;;納米三羥異黃酮Caco-2細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)[J];合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2018年11期

3 王明星;張艷秋;肖旭朗;;基于H_2O_2誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞模型的猴頭菌多糖抗?jié)冃越Y(jié)腸炎活性研究[J];時(shí)珍國醫(yī)國藥;2017年10期

4 王曉東;李秋霞;;Caco-2細(xì)胞單層模型中新穿心蓮內(nèi)酯的吸收機(jī)制觀察[J];山西醫(yī)藥雜志;2018年14期

5 周本宏;李曠宇;姜姍;吳s

本文編號：2808901