【摘要】：背景:卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,它的發(fā)病率位列宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌之后,排名第三。但其死亡率位居?jì)D科腫瘤的首位,是婦科腫瘤患者最主要的致死原因。目前,相關(guān)的統(tǒng)計(jì)資料表明導(dǎo)致女性死亡的各類惡性腫瘤中,卵巢癌的致死率位列第五位。因此,卵巢癌被視為一種嚴(yán)重危害女性身體健康以及生命安全的疾病。卵巢癌病理組織分型復(fù)雜多樣,其中上皮性卵巢癌所占比例最高,約為85%-90%。盡管醫(yī)學(xué)的診斷、治療水平不斷提高,影像、檢驗(yàn)等檢查手段日益先進(jìn),但由于卵巢癌起病隱匿,早期患者缺乏典型的癥狀和體征,醫(yī)療機(jī)構(gòu)缺少有效的、敏感的早期檢查、檢驗(yàn)手段,以致大約70%的卵巢癌患者臨床確診時(shí)己進(jìn)展到腫瘤晚期(FIGO分期Ⅲ/Ⅳ),手術(shù)治療效果欠佳,加之卵巢癌容易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的特點(diǎn),致使晚期卵巢癌患者在接受了規(guī)范化、系統(tǒng)化的治療后,5年的生存率仍然很低,僅有30%左右。當(dāng)前,卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是手術(shù)治療,術(shù)后輔助以鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療,但化學(xué)藥物治療可能出現(xiàn)明顯的毒副作用,如惡心、嘔吐的消化道癥狀、骨髓造血的抑制作用,肝腎功能的毒性損傷等等,影響了患者的生活質(zhì)量以及治療依從性,并且更為嚴(yán)重的是,部分患者出現(xiàn)了化療耐藥,影響了治療效果。因此,尋找高效的、新型的、毒副作用小的抗卵巢腫瘤新藥物,以期提高卵巢癌治療效果,改善卵巢癌預(yù)后,逆轉(zhuǎn)化療耐藥,成為擺在我們面前,急需解決的問題。隨著對抗癌藥物的不斷研究,目前人類發(fā)現(xiàn)170余種抗腫瘤的小分子化合物,非人工合成的有130余種,其中近50%的化合物為真菌提取物,它們具有穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)、獨(dú)特的分子活性,在抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻止細(xì)胞轉(zhuǎn)移、誘發(fā)細(xì)胞自噬等方面發(fā)揮重要作用。部分真菌提取物已經(jīng)應(yīng)用于抗腫瘤的臨床治療中,比如從云芝中萃取的云芝多糖-PSK(Krestin),從蘑菇的毒素中提取的Irofulven(中文名伊羅夫文)等藥物,在臨床治療中取得了不錯(cuò)的療效,表明這類小分子化合物具有明顯的抗癌作用。卵巢癌嚴(yán)重危害女性健康甚至生命,盡管對卵巢癌的研究不斷深入,治療手段不斷進(jìn)步,但多年來,卵巢癌的治療效果沒有大的突破,一直處于平臺期,從真菌提取物中尋找、發(fā)現(xiàn)治療卵巢癌的新物質(zhì)是我們的目標(biāo)。奇果菌素(Grifolin,2-trans,trans-farnesyl-5-methylresorcinol),英文名稱grifolin,分子式為C22H32O2,分子量為328,是一種從地花蘑菇子實(shí)體中分離出的二級代謝產(chǎn)物,它類屬于擔(dān)子菌類,在化學(xué)構(gòu)成上,是一種法尼基酚類小分子化合物,具有調(diào)節(jié)血脂、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤的作用,以往研究表明奇果菌素能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長,如人乳腺癌細(xì)胞MCF7,人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480,人宮頸癌細(xì)胞Hela、慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562等細(xì)胞。奇果菌素通過多種方式、多條途徑發(fā)揮抗癌作用,比如奇果菌素能夠通過ERK5通路,阻斷鼻咽癌細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制腫瘤細(xì)胞生長。Luo XJ等學(xué)者還發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌細(xì)胞中,奇果菌素能通過P53信號通路,上調(diào)DAPK1,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡,控制癌癥的進(jìn)展,該團(tuán)隊(duì)通過研究還證實(shí)奇果菌素能夠通過調(diào)控ERK1/2-EIk1-DNMT1信號傳導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)上皮轉(zhuǎn)移因子的表達(dá),干擾腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲,揭示了奇果菌素抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。此外,研究發(fā)現(xiàn)奇果菌素能夠調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的Akt通路,促進(jìn)其自發(fā)的程序化死亡,即凋亡。以上研究揭示了奇果菌素具有巨大的抗癌潛能,表明它在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡、控制其侵襲、轉(zhuǎn)移等方面都有顯著的作用。研究目的:奇果菌素是一種天然小分子化合物,具有廣譜的抗腫瘤活性,在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗癌作用,其在上皮性卵巢癌細(xì)胞中的作用至今無相關(guān)的報(bào)道,本研究旨在探索其對上皮性卵巢癌細(xì)胞的影響以及相關(guān)的分子作用機(jī)制。1.方法:本研究在體外培養(yǎng)上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV3和HO8910細(xì)胞,對細(xì)胞施加不同濃度的奇果菌素,分別作用不同的時(shí)間,然后進(jìn)行MTT、平板克隆、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期、Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡、Western-Blot檢測蛋白分子、構(gòu)建體外移植瘤進(jìn)行藥物處理、高通量測序及相關(guān)生信分析等一系列的實(shí)驗(yàn),得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析。1.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT實(shí)驗(yàn))應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽攝取法檢測不同濃度的奇果菌素分別作用A2780、SKOV3和HO8910細(xì)胞不同的時(shí)間,再經(jīng)過一系列的處理與檢測后,計(jì)算出細(xì)胞的生存率。1.2平板克隆實(shí)驗(yàn)收取處于對數(shù)生長期的增殖活躍細(xì)胞,種植于六孔板,施用不同濃度的奇果菌素作用48小時(shí)后,再用不含奇果菌素的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育細(xì)胞,后經(jīng)固定、染色等處理后,計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)。1.3細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)不同濃度的奇果菌素作用卵巢癌細(xì)胞后,通過降解RNA,PI標(biāo)記DNA等處理后,FACScan flow cytometry測定各周期時(shí)相的細(xì)胞數(shù),檢測結(jié)果用WinMDIv2.9軟件進(jìn)行分析。1.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)用含不同濃度梯度奇果菌素的培養(yǎng)基預(yù)處理A2780、SKOV3、HO8910細(xì)胞,施加一系列相關(guān)處理后,加入碘化丙啶(propidium iodide)和膜聯(lián)蛋白(FITC-Annexin)進(jìn)行染色標(biāo)記,然后用FACScan flow cytometry進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測,檢測結(jié)果用WinMDI v2.9軟件進(jìn)行分析。1.5蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)Western-Blot實(shí)驗(yàn)方法檢測卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3、HO8910被不同濃度的奇果菌素作用后,與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、信號通路相關(guān)的蛋白分子如 CyclinD1、Bcl-2、Cleaved-Casepase3、Cleaved-PARP、p-ERK1/2和p-Akt等的表達(dá)變化。1.6體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奇果菌素對卵巢癌細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用采用皮下注射的方式構(gòu)建裸鼠卵巢癌細(xì)胞SKOV3的皮下移植瘤模型,采取胃灌注的方式對裸鼠施用奇果菌素。自皮下種植腫瘤細(xì)胞的第一天始,藥物處理組每天灌注玉米油溶解的奇果菌素,對照組灌注同等量玉米油。待對照組最大瘤體直徑生長至1.5cm時(shí),處死小鼠并取瘤稱量,固定后行免疫組化檢測Ki67、CDK4、CyclinD1、Bcl-2、Bax等分子的表達(dá),并與對照組進(jìn)行比較。1.7生物信息學(xué)分析通過高通量測序比較經(jīng)過Grifolin處理和對照組卵巢癌細(xì)胞mRNA的差異,并應(yīng)用qRT-PCR、Western Blot及免疫組化等技術(shù),探索Grifolin對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)作用的分子機(jī)制。1.8統(tǒng)計(jì)方法為保證結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)、準(zhǔn)確,所有數(shù)據(jù)的獲得均通過三次不同的實(shí)驗(yàn),并采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式予以表達(dá),所得數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析,P0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1奇果菌素抑制卵巢癌細(xì)胞的生長MTT實(shí)驗(yàn)方法檢測奇果菌素作用前后的卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3和HO8910的生長率,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,奇果菌素對卵巢癌細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用,并且表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性以及濃度依賴性。2.2奇果菌素降低卵巢癌細(xì)胞的集落形成力平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測奇果菌素對單個(gè)卵巢癌細(xì)胞的增殖影響,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,隨著藥物濃度的增加,單個(gè)細(xì)胞的活力降低,增殖數(shù)減少,克隆數(shù)降低。2.3奇果菌素阻滯卵巢癌細(xì)胞的周期進(jìn)展細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測了不同濃度奇果菌素作用于A2780、SKOV3和HO8910細(xì)胞后,細(xì)胞周期的分布情況,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,隨著藥物濃度的增加,G1時(shí)相的細(xì)胞比例逐漸升高,說明奇果菌素阻滯細(xì)胞周期于G1期。2.4奇果菌素促進(jìn)A2780、SKOV3和HO8910細(xì)胞的凋亡FITC-Annexin V/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡試驗(yàn),對比了奇果菌素處理前后的A2780、SKOV3、HO8910細(xì)胞的凋亡數(shù)量,數(shù)據(jù)顯示,早期凋亡的細(xì)胞比例隨奇果菌素的濃度加大而逐漸攀升,晚期凋亡或壞死的細(xì)胞比例也出現(xiàn)了小幅遞增,表明隨著奇果菌素濃度的加大,細(xì)胞凋亡比例逐漸遞增。2.5 Western-blot法檢測了相關(guān)蛋白分子的表達(dá)變化奇果菌素抑制了 CyclinD1和CDK4的蛋白分子表達(dá),阻斷卵巢癌A2780、SKOV3、HO8910細(xì)胞從G1期進(jìn)入到S期。奇果菌素增加了Caspase-3和PARP剪切片段的表達(dá),改變了 Bax/B cl-2的比值,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。2.6體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明奇果菌素可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡裸鼠皮下種植SKOV3細(xì)胞后,隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組,自皮下種植腫瘤細(xì)胞的第一天起,兩組小鼠分別胃灌注玉米油溶劑和溶有奇果菌素的玉米油。生長曲線顯示奇果菌素處理組卵巢癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)有更慢的增殖速度,藥物處理組移植瘤平均重量明顯小于對照組。移植瘤進(jìn)行染色分析示,對照組Ki67、CDK4、CyclinD1染色深染,表明其更強(qiáng)的增殖能力,而藥物處理組Ki67、CDK4、CyclinD1染色變淺,表明增殖能力減弱,藥物處理組相比于對照組Bax染色深染,Bcl-2染色變淺,表明藥物促進(jìn)了其凋亡,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明奇果菌素有效抑制卵巢癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。2.7高通量測序結(jié)果顯示,奇果菌素處理后,卵巢癌細(xì)胞中PI3K/Akt和ERK1/2通路明顯被抑制,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)過Grifolin處理后,卵巢癌細(xì)胞中Akt和ERK1/2的磷酸化水平明顯降低,經(jīng)過Grifolin處理后,移植瘤中p-ERK和p-Akt染色變淺,表明藥物抑制了 ERK和Akt的磷酸化。3.結(jié)論3.1奇果菌素抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,將細(xì)胞有絲分裂阻滯于G1期,減緩了細(xì)胞的分裂增殖。3.2奇果菌素誘導(dǎo)了卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。3.3上皮性卵巢癌細(xì)胞系存在ERK1/2和PI3K/Akt通路的活化,奇果菌素能夠下調(diào)ERK1/2和Akt的磷酸化水平,其抗癌作用的發(fā)揮與降調(diào)ERK1/2和PI3K/Akt通路的活性有關(guān)。3.4構(gòu)建動(dòng)物模型,進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)奇果菌素可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。3.5奇果菌素具有獨(dú)特、穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu),顯著的抗癌作用,它為卵巢癌的治療提供了新的思路,值得進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖１．２：奇果菌素抑制卵巢癌細(xì)胞的克隆形成能力逡逑（Ａ－Ｃ）不同濃度的奇果菌素處理卵巢癌細(xì)胞Ａ２７８０（Ａ）、邋ＳＫＯＶ；３（Ｂ）逡逑Ｈ０８９ｌＯ（Ｃ）后，通過克隆實(shí)驗(yàn)檢測單個(gè)細(xì)胞的增殖與克隆形成能力，逡逑實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)各重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著逡逑奇果菌素藥物濃度的加大，集落形成數(shù)減少，克隆能力降低。逡逑＜０．０５ｖｓ0ｎＭ邋對照組。逡逑４９逡逑

５０邐７５逡逑圖１．２：奇果菌素抑制卵巢癌細(xì)胞的克隆形成能力逡逑（Ａ－Ｃ）不同濃度的奇果菌素處理卵巢癌細(xì)胞Ａ２７８０（Ａ）、邋ＳＫＯＶ；３（Ｂ）逡逑和Ｈ０８９ｌＯ（Ｃ）后，通過克隆實(shí)驗(yàn)檢測單個(gè)細(xì)胞的增殖與克隆形成能力，逡逑實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)各重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著逡逑奇果菌素藥物濃度的加大，集落形成數(shù)減少，克隆能力降低。逡逑Ｐ＜０．０５ｖｓ0ｎＭ邋對照組。逡逑４９逡逑

５０邐７５逡逑圖１．３：奇果菌素阻滯卵巢癌細(xì)胞周期的進(jìn)展逡逑（Ａ－Ｃ）分別用邋２５（ｉＭ、５０｜＾Ｍ、７５）＾Ｍ邋奇果菌素處理邋Ａ２７８０（Ａ）、逡逑ＳＫ０Ｖ３（Ｂ）和ＨＯ８９１０（Ｃ）細(xì)胞２４小時(shí)后，力口用乙醇固定細(xì)胞，后經(jīng)ＲｎａｓｅＡ逡逑和ＰＩ等試劑處理細(xì)胞，最后應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)對細(xì)胞周期進(jìn)行測定，發(fā)逡逑現(xiàn)隨著奇果菌素藥物濃度梯度的增加，處于Ｇ１期的細(xì)胞比例逐漸增加，逡逑試驗(yàn)數(shù)據(jù)是三次不同試驗(yàn)的累計(jì)。Ｐ＜０．０５ｖｓ０ｆｉＭ對照組。逡逑５０逡逑

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本文編號：2805400